高效液相色譜法測定運動營養食品中黃曲霉毒素M1方法研究

戴云華，祁 奇

（常州市食品藥品纖維質量監督檢驗中心，江蘇常州 213000）

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是一種強烈的致癌物質，是曲霉菌等菌類的高毒代物。1993年黃曲霉毒素被世界衛生組織（World Health Organization，WHO）定為Ⅰ類致癌物，能使人體或動物的免疫功能喪失，誘導畸形、癌癥的發生[1]。黃曲霉毒素M1的毒性和致癌性與黃曲霉毒素B1相當，因此含有黃曲霉毒素M1的牛奶危害很大[2]。多數政府機構都對人體和動物可攝入的黃曲霉毒素量有嚴格的法規限制。很多國家已經對牛奶和乳制品中的黃曲霉毒素M1含量有了明確的限量標準[3]。

運動營養食品是為滿足運動人群的生理代謝狀態、運動能力及對某些營養成分的特殊需求而專門加工的食品。為了滿足營養補給，一般的代餐和蛋白棒中的主蛋白粉基本是濃縮乳清蛋白粉、濃縮牛奶蛋白粉等。我國食品安全國家標準中規定了乳及乳制品、含乳特殊膳食用食品、運動營養食品等各類別中AFM1的限量，但在《食品國家安全標準 食品中黃曲霉毒素M族的測定》（GB 5009.24—2016）中并沒有涉及到運動營養食品中AFM1的檢測方法。本文通過甲醇提取，由免疫親和柱凈化為前處理手段，氮吹復溶后通過液相色譜熒光檢測器檢測，建立了操作簡單、靈敏度高、可廣泛推廣的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃曲霉毒素M1標準溶液（10.3 μg/mL），浙江農科院；黃曲霉毒素M1免疫親和柱，上海必諾檢測技術服務有限公司；甲醇、乙腈，默克股份兩合公司；乳清蛋白棒，杭州衡美食品科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LC-20ADXR高效液相色譜儀（帶熒光檢測器），島津技邇（上海）商貿有限公司；Waters Symmetry C18色譜柱，沃特世科技（上海）有限公司；FOTECTOR PLUS全自動固相萃取儀，?？萍瘓F股份有限公司；CP513電子天平（千分之一），奧豪斯儀器（常州）有限公司；高速冷凍離心機，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；TurboVap LV氮吹儀，拜泰齊貿易（上海）有限公司；渦旋儀，德國IKA。

1.3 實驗方法

1.3.1 標液配制

將標準品溶液儲備液（10.3 μg/mL）用乙腈稀釋成40 ng/mL的標準工作液，分別準確移取標準工作液12.5 μL、25.0 μL、50.0 μL、125.0 μL、250.0 μL、500.0 μL及1 250.0 μL至10 mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，搖勻，配制成0.05 ng/mL、0.10 ng/mL、0.20 ng/mL、0.50 ng/mL、1.00 ng/mL、2.00 ng/mL和5.00 ng/mL的標準品溶液，進行分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A：甲醇+乙腈（1∶1），流動相B：水；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；熒光檢測波長：激發波長360 nm、發射波長430 nm；進樣體積：50 μL。

1.3.3 樣品前處理

（1）提取。稱取1 g粉碎均勻的乳清蛋白棒（精確到0.001 g）于50 mL離心管中，加入4 mL 50 ℃熱水渦旋混勻。加入10 mL甲醇，渦旋3 min。置于4 ℃、6 000 r/min下離心10 min。用玻璃纖維濾紙過濾至澄清。移取4.0 mL樣品提取液至50 mL離心管中，用40 mL水稀釋，混勻備用。

（2）凈化。將上述樣液以約1 mL/min的速度注入免疫親和柱內，帶樣液滴完后，用10 mL水淋洗親和柱，真空抽干親和柱，然后用2 mL甲醇以1 mL/min的速度洗脫，收集全部洗脫液至刻度試管中。該步驟用了兩種方法：①固相萃取儀，在設置凈化方法時需注意上樣的速度，上樣后需清洗注射器，淋洗速度也要慢；②手動過柱，同樣需要注意上樣和淋洗的速度，經比對，回收率相差不大。固相萃取儀更方便，效率高。

（3）氮吹復溶。在50 ℃下氮氣緩緩地將上述洗脫液吹至約0.5 mL，加入流動相復溶定容至1 mL，渦旋30 s溶解殘留物，經0.22 μm微孔濾膜過濾后，用高效液相色譜儀分析。同時做空白實驗。注意氮吹時不能吹干，以免造成AFM1的流失。復溶后要混勻。

2 結果與分析

2.1 實驗結果

經檢驗，空白實驗和樣品乳清蛋白棒中的黃曲霉毒素M1均為陰性。黃曲霉毒素M1標樣的液相色譜圖見圖1。

圖1 黃曲霉毒素M1的液相色譜

2.2 標準工作曲線

配制的黃曲霉毒素M1標準工作曲線濃度為0.05 ng/mL、0.10 ng/mL、0.20 ng/mL、0.50 ng/mL、1.00 ng/mL、2.00 ng/mL和5.00 ng/mL，以黃曲霉毒素M1濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，線性方程為Y=34 616X-68.307，R2=1。見圖2。

圖2 黃曲霉毒素M1的標準工作曲線

2.3 檢出限

將標準品溶液儲備液稀釋成一系列不同濃度的標準品溶液，分別為0.10 ng/mL、0.07 ng/mL、0.05 ng/mL和0.02 ng/mL，并進樣分析，以3倍信噪比作為檢出限，得出黃曲霉毒素M1的檢出限為0.07 μg/kg。

2.4 精密度

取標準品溶液（1 ng/mL），連續進樣6次，結果分別為0.980 ng/mL、0.977 ng/mL、0.986 ng/mL、0.988 ng/mL、0.978 ng/mL及0.979 ng/mL，黃曲霉毒素M1的RSD值為0.463%，表示精密度良好，實驗結果較為滿意。

2.5 重復性試驗

取試樣加標（加入濃度為3.5 ng/mL的黃曲霉毒素標準溶液0.1 mL），換算值為0.35 μg/kg，按照上述檢驗方法檢測分析，測定6平行，結果分別為0.339 6 μg/kg、0.332 8 μg/kg、0.336 0 μg/kg、0.346 6 μg/kg、0.329 2 μg/kg 及 0.336 1 μg/kg， 黃 曲 霉 毒 素 M1的RSD為1.78%，可見重復性良好，實驗結果較為滿意。

2.6 回收率試驗

取樣品（樣品空白顯示陰性）1 g，加入濃度為3.5 ng/mL的黃曲霉毒素標準溶液0.05 mL、0.10 mL、0.50 mL（換算值為0.175 μg/kg、0.350 μg/kg、1.750 μg/kg），檢測結果見表1，平均回收率為96.78%，從而可以看出此方法可以滿足檢測要求。

表1 回收率檢驗結果

2.7 穩定性試驗

取上述的重復性試驗用試樣，6 h進樣一次分析，記錄峰面積，結果顯示，在24 h之內，峰面積相差不大，判定黃曲霉毒素M1的化學性質基本穩定。

3 結果與討論

該研究方法基于免疫親和柱對黃曲霉毒素吸附的專一性，在原始的HPLC方法上加以優化改進，找到最合適的凈化和分離條件，利用HPLC的良好分離效果，達到了靈敏、準確的檢測效果[4]。原標準中洗脫用的是4 mL乙腈，再氮氣吹至近干，乙腈相對來說毒性比較大，氮吹至干的操作會直接影響最終測定結果的準確性[5]。經研究證明，用2 mL甲醇進行洗脫即可將黃曲霉毒素M1洗脫完全，氮吹也不能吹干，控制在0.5 mL左右，復溶至1 mL，結果證明測定結果較準確，回收率較高。本文建立了測定運動營養食品中黃曲霉毒素M1的高效液相色譜法，前處理并不復雜，熒光檢測器靈敏度高，實驗結果穩定性和重現性均較好，回收率高，是可切實推廣的HPLC標準檢測方法。