0.1%納米銀溶液對慢性根尖周炎大鼠RORγT、IL-17及Foxp3表達的影響

孫新新 迪麗努爾·阿卜拉 劉濤 羅甜甜 王邦耀 陳越 劉奕杉

[摘要]目的：探討0.1%納米銀溶液用于根管封藥對慢性根尖周炎大鼠RORγT、IL-17、Foxp3表達的影響。方法：對40只雄性大鼠雙側下頜第一磨牙開髓建立根尖周炎模型，術后2周處死4只大鼠用RVG+HE判斷造模成功，將剩余36只大鼠隨機均分為空白對照組（K組），氫氧化鈣組（Q組）及0.1%納米銀溶液組（N組）。于用藥后7、14、21 d各組隨機處死4只大鼠，免疫組織化學檢測Foxp3表達，qRT-PCR檢測RORγT、IL-17的表達。結果：免疫組化顯示3組于用藥7、14、21 d時Foxp3表達呈逐漸上升趨勢，N、Q組均高于K組（P<0.05）。qRT-PCR顯示，N組RORγT、IL-17表達在14、21 d均低于K組（P<0.05），21 d時，N較Q組IL-17表達無差異（P>0.05），RORγT表達有差異（P<0.05）。結論：0.1%納米銀溶液用于根管封藥效果好，可降低RORγT、IL-17水平，促進Foxp3的表達。

[關鍵詞]0.1%納米銀溶液;慢性根尖周炎;RORγT;IL-17;Foxp3

[中圖分類號]R781.34? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2022）03-0087-03

Effects of 0.1% Nano-silver Solution on the Expression of RORγT， IL-17 and Foxp3 in Rats with Chronic Periapical Inflammation

SUN Xinxin1，Dilinuer·ABULA1，LIU Tao2，LUO Tiantian1，WANG Bangyao1，CHEN Yue1，LIU Yishan1

[1.Department of Pediatric Stomatology-Oral Prophylaxis，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University（Affiliated Stomatological Hospital），Xinjiang Uygur Autonomous Region Institute of Stomatology，Urumqi 830000，China; 2.Medical Laboratory Center of the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830000，Xinjiang，China]

Abstract： Objective To investigate the effect of 0.1% nano-silver solution as root canal sealing agent on the expression levels of RORγT， IL-17 and Foxp3 in rats with chronic periapical inflammation. Methods The model of periapical inflammation was established by opening the pulp of the first mandibular molars of rats. Two weeks after surgery， Hematoxylin-eosin （HE） staining was performed to judge the success of modeling. The rats were randomly divided into blank control group （K group）， calcium hydroxide paste group （Q group） and 0.1% nano silver solution group （N group）. Four rats in each group were randomly sacrificed on day 7， 14 and 21 after administration， and Foxp3 expression was detected by immunohistochemistry. Quantitative real-time polymerase chain reaction （QRT-PCR） was used to detect the expression of RORγT and IL-17. Results Immunohistochemistry showed that Foxp3 expression in group N was significantly higher than that in group K （P<0.05）， and increased gradually with the extension of medication time. QRT-PCR showed that the expression of RORγT and IL-17 in N group was lower than that in K group at 7， 14 and 21 days （P<0.05）， and decreased gradually with time. Conclusion? 0.1% nano silver solution was effective for root canal sealing， which could reduce RORγT and IL-17 levels and promote Foxp3 expression.

Key words： 0.1% nano-silver solution; chronic periapical disease; RORγT; IL-17; Foxp3

慢性根尖周炎是牙齒根尖部及其周圍組織的慢性炎癥，主要由細菌感染引起，就診率高，嚴重時可影響患者生活質量[1]。其主要病理表現是根尖周組織的炎癥反應和骨質破壞，若能抑制炎癥的發生，根尖周炎的進展便會被明顯抑制。

氫氧化鈣在根管消毒中至關重要，可有效清除病原體，防止疾病復發。但有研究表明，氫氧化鈣滲入牙本質小管深度有限，封藥后難以徹底清除[2]。納米銀作為一種新型抑菌材料，有較強滲透及殺菌作用，應用較為廣泛[3]。研究發現，Th17和Treg細胞在慢性根尖周炎進展中分別發揮著相反的生物學作用。因此，本研究擬建立實驗性根尖周炎模型，采用0.1%納米銀溶液用于根管封藥治療慢性根尖周炎，探討其對根尖周組織中Th17型細胞因子（IL-17、RORγT）及Treg型細胞因子（Foxp3）的影響，以期為探尋新型根管消毒藥物提供實驗依據。

1? 材料和方法

1.1 實驗動物：選用40只5周齡SD雄性大鼠，體重（150±5）g（由新疆醫科大學實驗動物中心提供）。本研究經新疆醫科大學生物醫學倫理委員會實驗動物福利倫理分會批準（批準號：IACUC20201225-23）

1.2 動物模型建立和分組：大鼠適應性飼養1周，腹腔注射10%水合氯醛（3 ml/kg），仰臥固定，1/4球鉆對雙側下頜第一磨牙開髓，15#K銼清理。術后2周隨機處死4只大鼠RVG+HE判斷造模成功（詳見結果2.1），將剩余36只大鼠隨機分為空白對照組（K組），氫氧化鈣組（Q組）及0.1%納米銀溶液組（N組），每組12只。其中K組對根管行疏通、預備、沖洗，隔濕干燥后，置入PBS棉球;Q組置入氫氧化鈣糊劑;N組置入0.1%的納米銀溶液棉球。進口玻璃離子充填暫封窩洞，調整咬合及高點。于用藥后7、14、21 d各組隨機處死4只大鼠，免疫組織化學檢測Foxp3表達，實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction， qRT-PCR）檢測RORγT、IL-17的表達。

1.3 組織學檢查（HE+免疫組織化學）：用藥7、14、21 d后，大鼠左側下頜骨去盡牙齦等軟組織，4%多聚甲醛溶液固定48 h，EDTA脫鈣液脫鈣30 d，乙醇梯度脫水后浸蠟包埋。沿磨牙長軸近遠中向連續切片4 μm，蘇木素伊紅（HE）染色。切片行胃蛋白酶抗原修復，山羊血清封閉，滴加一抗，以PBS代替一抗作為空白對照，4℃孵育過夜。次日按試劑盒說明書行免疫組化染色，顯微鏡下觀察Foxp3表達并采圖。用ImagePro Plus 6.0軟件半定量分析Foxp3表達并計算平均光密度值。

1.4 qRT-PCR

1.4.1 RNA提取：取用藥7、14、21 d后大鼠右側下頜第一磨牙根尖周骨組織樣品，液氮研磨、Trizol法提取并純化組織的RNA，選取OD260/OD280比值在1.8～2.0的標本放于-80°冰箱保存或立即PCR。

1.4.2 qRT-PCR反應：采用二步法將RNA反轉錄為對應的cDNA模板，根據PCR試劑盒于PCR儀行擴增反應，反應體系為20 ul：上下游引物各1.4 ul，模板cDNA 2.0 ul。反應條件：95℃、2 min;95℃、5 s;59℃、30 s，循環40次。每組樣本設3個復孔，GAPDH為內參基因，通過2-△△Ct法分析基因的相對表達水平。引物序列見表1。

1.5 統計學分析：采用SPSS 25.0統計軟件進行統計學分析，計量資料采用xˉ±s表示，多組比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1 大鼠慢性根尖周炎模型的建立（RVG+HE）：如圖1A箭頭處所示，術后2周，RVG結果可見隨機抽取的大鼠根尖部有明顯的低密度暗影;如圖1B箭頭處所示，HE染色結果顯示，牙髓壞死，根尖區病灶可見淋巴細胞浸潤。

2.2 組織學變化：K組于未用藥14 d時Foxp3表達隨著炎癥的進展開始緩慢升高，差異有統計學意義（P<0.05）;Q組用藥7、14、21 d時，Foxp3表達逐漸升高，組內對比差異有統計學意義（P<0.05）;N組用藥14、21 d時，Foxp3表達高于K組，差異有統計學意義（P<0.05），用藥14、21 d時N與Q組對比，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2～3。

2.3 qRT-PCR結果：用藥7、14、21 d，N、Q組IL-17表達較K組均下降，差異有統計學意義（P<0.05），但N組較Q組IL-17表達，差異無統計學意義（P>0.05）。用藥7 d，N、Q組RORγT表達較K組下降無統計學意義，N組較Q組RORγT表達，差異無統計學意義（P>0.05）。用藥14 d，N、Q組RORγT表達較K組下降，差異有統計學意義（P<0.05），N組較Q組RORγT表達，差異無統計學意義（P>0.05）。用藥21 d，N、Q組RORγT表達較K組下降，差異具有統計學意義（P<0.05），N組較Q組RORγT表達，差異具有統計學意義（P<0.05）。見表2～3。

3? 討論

Th17細胞以分泌IL-17為特征，需要RORγT參與啟動其增殖及分化過程，具有促炎作用[4]。目前，在人和大鼠慢性根尖周炎病變組織中已檢測到IL-17表達[5]。RORγT在健康根尖周組織中幾乎不表達，在根尖周病變組織中其表達量顯著升高[6]。此外，在被敲除RORγT基因的小鼠體內發現Th17細胞及IL-17的表達較正常小鼠顯著減少。研究認為，一定程度上RORγT的含量可大致代表Th17細胞含量。

Treg細胞具有免疫抑制功能，以表達Foxp3為特點，分泌IL-10、TGF-β等抗炎因子，維持機體內環境穩態，控制免疫介導的組織損害[7]。有文獻報道，Treg參與調節慢性根尖周炎進程，發揮抑炎及促炎雙向調節作用[8]。Foxp3在根尖周病慢性期表達增高，提示Foxp3可抑制過度活化的T細胞，保護機體免受過度炎癥反應造成的組織損傷[9]。Th17和Treg細胞正常狀態下二者保持相對穩定，當慢性根尖周炎發生時，將誘導Th17分泌增加，導致Th17/Treg比例失衡，加速慢性根尖周炎進展[10]。因此，對大鼠根尖周組織中IL-17、RORγT及Foxp3水平的檢測，可大致反映Th17和Treg的表達變化，為臨床治療提供依據。

另有研究發現納米銀滲透作用及生物安全性好，易去除，已應用于各種領域。納米銀的抑菌效果和相對細胞毒性與其濃度呈正相關[11-12];濃度低于25 g/L的納米銀顆粒無細胞毒性。加入納米銀的新型根管封閉劑可再生牙本質礦物質，增加牙本質硬度[13];納米顆粒抗菌劑因能破壞生物膜并防止細菌粘附，已被提出作為治療根管內感染的替代方案[14]。當前，也有研究顯示，0.1%納米銀溶液的應用對根尖周組織無刺激性[15]，較為安全。

qRT-PCR結果示N、Q組在14、21 d時IL-17、RORγT表達較K組均下調，21 d時，N較Q組IL-17表達無統計學意義，RORγT表達有差異。免疫組化結果示K組隨慢性期延長Foxp3表達增高，但未有效終止炎癥。N、Q組Foxp3表達較K組上升，且21 d較7 d增加有顯著性差異，提示Treg分泌的抑炎因子數量及效能的增加，可減輕根尖周組織病損。以上結果表明納米銀的應用可抑制炎癥因子表達，并促進Foxp3分泌，使Th17/Treg免疫平衡恢復正常，促進根尖周組織恢復，進一步驗證了Th17/Treg免疫平衡的機制。

綜上所述，0.1%納米銀溶液能有效控制根尖周組織炎癥，可降低IL-17、RORγT表達，提高Foxp3水平，這為探尋新的根管消毒藥物提供了新的研究思路。本研究不足之處在于僅探討了封藥7、14、21 d時0.1%納米銀溶液的效果，其長遠療效及納米銀最佳抑菌效果在后續細胞或動物實驗中需建立時間或藥物濃度梯度以進一步研究。

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[收稿日期]2021-09-14

本文引用格式：孫新新，迪麗努爾·阿卜拉，劉濤，等.0.1%納米銀溶液對慢性根尖周炎大鼠RORγT、IL-17及Foxp3表達的影響[J].中國美容醫學，2021，31（3）：87-90.