高效液相色譜法分析丹參飲片等級(jí)*

謝 娟, 伍 慶, 吳珊珊,2, 李 瑋,2

丹參為唇形科植物丹參SaLvia miLtiorrhizaBge 的干燥根及根莖, 具有活血祛瘀、 通經(jīng)止痛、 清心除煩、 涼血消癰的功效, 主治月經(jīng)不調(diào)、 閉經(jīng)痛經(jīng)、 產(chǎn)后瘀滯、 腹痛、 神經(jīng)衰弱、冠心病、 心絞痛等[1]。 研究表明丹參化學(xué)成分主要有脂溶性成分丹參酮類、 丹參酮ⅡA、 丹參酮Ⅰ、 隱丹參酮等, 水溶性成分丹酚酸B、 丹參素、 迷迭香酸、 原兒茶醛、 咖啡酸等[2-4],是丹參抗心血管疾病的活性成分。 其藥理作用主要有抗血小板聚集、 抗血栓形成、 抗氧化、 清除自由基、 抗炎、 抑制血管平滑肌等[5-9]。 本文通過測(cè)定傳統(tǒng)及現(xiàn)代指標(biāo), 通過數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析, 探索傳統(tǒng)指標(biāo)與現(xiàn)代指標(biāo)相關(guān)性, 并結(jié)合市場(chǎng)及聚類分析結(jié)果進(jìn)行飲片等級(jí)劃分, 為丹參飲片的綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù), 實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)、 規(guī)范市場(chǎng)監(jiān)管。

1 材 料

1.1 主要儀器

Agilent 1100 高效液相色譜儀, 美國(guó)安捷倫科技有限公司;ME204 萬分之一電子天平, 上海梅特勒-托利多儀器有限公司;游標(biāo)卡尺(量程0 ～200 mm), 上海恒量量具有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

丹參酮IIA(中國(guó)食品藥品檢定研究院, 批號(hào)110766-201721); 隱丹參酮(中國(guó)食品藥品檢定研究院, 批號(hào)110885-200102); 丹酚酸B(中國(guó)食品藥品檢定研究院, 批號(hào)111562-201416); 迷迭香酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院, 批號(hào)111871-201404); 甲醇、 乙腈為色譜純, 其余試劑為分析純, 水為娃哈哈純凈水。 丹參飲片共60 批, 均來自不同的生產(chǎn)廠家, 其藥材來源于3 個(gè)產(chǎn)地。 本實(shí)驗(yàn)所有樣品均為本校標(biāo)本館劉曉龍老師鑒定為唇形科植物丹參(SaLvia miLtiorrhizaBge)的干燥根及根莖。 樣品信息見表1。

表1 樣品信息表Table 1 Sample information table

續(xù)表1

2 方法與結(jié)果

2.1 水分含量測(cè)定

照2020 年版《中國(guó)藥典》通則(0832)項(xiàng)下第二法烘干法進(jìn)行測(cè)定, 不同批次丹參飲片水分含量結(jié)果見表2。

2.2 浸出物含量測(cè)定

照2020 年版《中國(guó)藥典》通則2201 項(xiàng)下浸出物測(cè)定法測(cè)定, 不同批次丹參飲片水溶性浸出物含量及醇溶性浸出物含量結(jié)果見表2。

2.3 丹參飲片含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件考察

色譜柱: Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm); 流動(dòng)相: 乙腈(B): 0.1%甲酸(A), 梯度洗脫(0 ～10 min: 10% ～20%B, 10 ～17 min: 20%B, 17 ～45 min: 20% ～33%B, 45 ～90 min: 33% ～100%B), 流速: 1 mL/min; 柱溫: 35 ℃; 檢測(cè)波長(zhǎng)為0 ～14 min: 270 nm; 14 ～33 min: 280 nm; 33 ～40 min: 270 nm; 40 ～65 min: 280 nm; 65 ～100 min: 270 nm。

2.3.2 供試品溶液的制備

取丹參藥材粗粉0.5 g, 精密稱定, 置具塞錐形瓶中, 精密加入50%甲醇25 mL, 密塞, 稱定重量, 超聲處理(功率300 W,頻率40 kHz)30 min, 放冷, 再稱定重量, 用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量。 搖勻, 濾過, 取續(xù)濾液, 即得。

2.3.3 對(duì)照品溶液的制備

混合對(duì)照品的制備: 取對(duì)照品適量, 制備成含迷迭香酸37.6 μg/mL, 丹酚酸B 0.896 mg/mL, 隱丹參酮13.4 μg/mL,丹參酮I 7.36 μg/mL, 丹參酮IIA 6.45 μg/mL 混合對(duì)照品溶液。

2.3.4 方法學(xué)驗(yàn)證

(1)線性范圍考察

分別取混合溶液2、 5、 10、 15、 20、 25 μL, 按照規(guī)定色譜條件進(jìn)樣, 測(cè)定峰面積, 以峰面積為縱坐標(biāo), 進(jìn)樣量為橫坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 得迷迭香酸, 丹酚酸B, 隱丹參酮, 丹參酮I, 丹參酮IIA 的回歸方程: Y迷迭香酸=362.06x-11.843(r=0.9998); Y丹酚酸B= 24.015x +0.374 (r= 0.9999); Y隱丹參酮=6.8663x+0.2087(r= 0.9998); Y丹參酮I= 26.765x-0.3373(r=0.9995); Y丹參酮IIA=72.333x+2.749(r=0.9997)。

結(jié)果表明迷迭香酸7.52 ～94 μg/mL; 丹酚酸B 0.1792 ～2.24 mg/mL; 隱丹參酮2.68 ～33.5 μg/mL; 丹參酮I 1.472 ～18.4 μg/mL; 丹參酮IIA 1.29 ～16.125 μg/mL 范圍與峰面積呈良好線性關(guān)系。

(2)精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液按“2.3.1 色譜條件” 項(xiàng)下連續(xù)進(jìn)樣6 次,計(jì)算迭香酸, 丹酚酸B, 隱丹參酮, 丹參酮I, 丹參酮IIA 峰面積的RSD 值分別為2.1%、 1.5%、 0.8%、 2.7%、 2.6%, 表明精密度良好。

(3)重復(fù)性試驗(yàn)

取丹參粉末(1712011)0.5 g 共6 份, 在“2.3.1 色譜條件”項(xiàng)下進(jìn)樣分析, 計(jì)算迭香酸, 丹酚酸B, 隱丹參酮, 丹參酮I,丹參酮IIA 峰面積的RSD 值分別為1.5%、 2.0%、 1.9%、1.5%、 0.75%, 表明方法重復(fù)性良好。

(4)穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液(1712011)分別在0、 2、 4、 8、12、 24 h 按“2.3.1 色譜條件” 項(xiàng)下進(jìn)行測(cè)定, 結(jié)果迷迭香酸,丹酚酸B, 隱丹參酮, 丹參酮I, 丹參酮IIA 峰面積的RSD 值分別為2.3%、 1.8%、 1.2%、 0.6%、 2.1%。 結(jié)果表明供試品溶液在24 h 穩(wěn)定性良好。

(5)加樣回收試驗(yàn)

精密稱取已知含量的丹參粉末(1712011)取9 份, 分別約0.25 g, 精密稱定, 加50%甲醇25 mL 精密稱定, 再分別精密加入濃度分別為1.88 mg/mL 迷迭香酸175 μL、 220 μL、 260 μL;2.24 mg/mL 丹酚酸B2.2 mL、 2.7 mL、 3.3 mL;0.67 mg/mL 隱丹參 酮255 μL、 320 μL、 384 μL; 0.46 mg/mL 丹 參 酮I 221 μL、 277 μL、 332 μL; 0.43 mg/mL 丹參酮IIA 410 μL、510 μL、 610 μL。 超聲處理30 min, 取出, 放冷, 精密稱定,以50%甲醇補(bǔ)重, 搖勻, 濾過, 取續(xù)濾液, 即得。 按“2.3.1色譜條件” 項(xiàng)下測(cè)定, 結(jié)果迷迭香酸, 丹酚酸B, 丹參酮類(隱丹參酮, 丹參酮I, 丹參酮IIA)平均回收率分別為96.52%、97.68%、 98.50%、 99.21%、 94.67%, RSD 為1.3%、 0.8%、1.5%、 2.0%、 1.8%。

2.3.5 含量測(cè)定結(jié)果

取不同批次丹參飲片樣品適量, 照“2.3.2 供試品溶液的制備” 項(xiàng)下制備供試品溶液, 照“2.3.1 色譜條件” 項(xiàng)下測(cè)定, 不同批次丹參飲片中迷迭香酸、 丹酚酸B、 丹參酮類成分含量見表2。

表2 丹參不同等級(jí)樣品信息及外觀、 內(nèi)在指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection results of information, appearance and internal indexes of different grades of Salvia miltiorrhiza samples

續(xù)表2

3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)測(cè)定的丹參片徑、 水分、 水溶性浸出物、 醇溶性浸出物、 迷迭香酸、 丹酚酸B、 丹參酮類等指標(biāo)通過IBM SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3.1 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化

將不同批次丹參樣品指標(biāo)數(shù)據(jù)導(dǎo)入IBM SPSS Statistics 20中, 將數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理, 得到標(biāo)準(zhǔn)化Z-得分。

3.2 丹參飲片等級(jí)劃分指標(biāo)的篩選

采用描述統(tǒng)計(jì)分析對(duì)丹參的7 個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行篩選結(jié)果不同批次丹參片徑、 迷迭香酸、 丹酚酸B、 丹參酮類的指標(biāo)變異系數(shù)較大, 分別為42.59%, 33.47%, 40.62%, 44.27%,96.58%, 可作為劃分丹參等級(jí)的指標(biāo), 結(jié)果見表3。

表3 丹參片徑及內(nèi)在成分指標(biāo)描述統(tǒng)計(jì)(n=60)Table 3 Description statistics of Salvia miltiorrhiza tablet diameter and internal components

通過對(duì)丹參片徑與迷迭香酸、 丹酚酸B、 丹參酮類含量、水分、 醇溶性浸出物、 水溶性浸出物進(jìn)行相關(guān)性分析, 相關(guān)性評(píng)價(jià)采用Pearson 相關(guān)系數(shù)。 結(jié)果片徑與水溶性浸出物、 迷迭香酸含量Pearson 相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值分別為0.425、 0.348, 雙側(cè)檢驗(yàn)P＜0.01, 表明片徑與水溶性浸出物、 迷迭香酸含量有極顯著相關(guān)性; 醇溶性浸出物、 丹酚酸B 含量與片徑呈極顯著正相關(guān); 片徑與丹參酮類含量、 水分的Pearson 相關(guān)系數(shù)均小于0.5, 說明沒有相關(guān)性, 結(jié)果見表4。

表4 7 個(gè)指標(biāo)相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of 7 indicators

3.3 主成分分析

選擇丹參飲片中7 個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)為變量, 運(yùn)用IBM SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)其進(jìn)行主成分分析。 結(jié)果第一主成分特征根為1.44, 貢獻(xiàn)率為20.59%; 第二主成分特征根為1.44, 累計(jì)貢獻(xiàn)率為41.18%; 第三主成分特征根為1.42, 累計(jì)貢獻(xiàn)率為61.57%; 第四主成分特征根為1.42, 累計(jì)貢獻(xiàn)率為81.86%。 綜合考慮特征根和貢獻(xiàn)率的大小, 選取第一、 第二、第三、 第四主成分進(jìn)行分析, 結(jié)合描述統(tǒng)計(jì)分析及相關(guān)性分析結(jié)果, 最終選取片徑、 迷迭香酸、 丹酚酸B、 丹參酮類4 個(gè)指標(biāo)評(píng)價(jià)飲片等級(jí), 結(jié)果見表5。

表5 主成分的特征及貢獻(xiàn)率Table 5 Characteristics and contribution rate of principal components

3.4 聚類分析

運(yùn)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析, 聚類方法選用組間聯(lián)接法, 以平方歐式距離為測(cè)量方法。 通過每個(gè)成分的貢獻(xiàn)度計(jì)算其綜合得分并進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn), 個(gè)別樣品不能很好的進(jìn)行聚類, 因此再進(jìn)行丹參片徑聚類分析, 當(dāng)分類距離為10時(shí), 可分為3 類; 當(dāng)分類距離為15 時(shí), 可分為兩類。 因此根據(jù)相關(guān)性分析和聚類分析結(jié)果, 并參考《商品飲片的分級(jí)方法及其質(zhì)量評(píng)價(jià)》將丹參分為一級(jí)、 二級(jí), 并將不進(jìn)行分等的丹參飲片定位統(tǒng)貨[10], 見圖1。

圖1 丹參片徑聚類圖Fig.1 Diameter cluster diagram of Salvia miltiorrhiza tablets

4 結(jié) 論

本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同批次間斷面顏色越深其丹參酮類含量越低, 斷面顏色為黃白色丹參酮類含量高于黃褐色; 斷面顏色與表面顏色對(duì)迷迭香酸含量影響較小, 不同批次間丹酚酸B 含量差異較大。

本實(shí)驗(yàn)通過變換波長(zhǎng)檢測(cè)法, 建立了同時(shí)測(cè)定丹參中迷迭香酸、 丹酚酸B、 丹參酮類(隱丹參酮、 丹參酮I、 丹參酮IIA)的含量測(cè)定方法, 該方法穩(wěn)定可靠。 能減少了藥典方法中丹酚酸B、 丹參酮類成分分開測(cè)定的檢測(cè)時(shí)間, 提高了檢測(cè)速率。

本文通過數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及現(xiàn)代分析方法相結(jié)合, 初步探討了丹參飲片片徑與內(nèi)在指標(biāo)的關(guān)系, 對(duì)丹參飲片等級(jí)劃分奠定了基礎(chǔ)。 在后續(xù)各等級(jí)飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)中增加現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵, 使飲片分級(jí)方法更為科學(xué)、 實(shí)用。 充分利用近年來的研究成果, 進(jìn)一步進(jìn)行飲片分級(jí)規(guī)格和質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)研究, 為該飲片的規(guī)范化生產(chǎn)中優(yōu)良種源的篩選提供了部分前期基礎(chǔ)。