青蒿素衍生物KPC-L006 對肺癌PC9 細胞的抗腫瘤作用

李 霞, 楊兆祥, 劉一丹, 吳俊珠, 黃 茜, 付傳美, 陳建勛, 劉軍鋒

肺癌, 又稱原發性支氣管肺癌, 長期以來都是全球范圍內公認的發病率和死亡率最高的惡性腫瘤, 根據國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer)發布的數據, 僅2018 年的統計中全球就有約210 萬新發肺癌病例, 180 萬肺癌死亡病例, 分別占惡性腫瘤新發病例及死亡病例的11.6%及18.4%[1]。 目前對于肺癌的治療方法主要有手術治療、 靶向治療、 全身化療、 放療及聯合治療等, 這些治療方式往往給患者的身心帶來極大的痛苦, 因此開發具有療效好、 毒副作用低的抗肺癌新型藥物已經成為腫瘤研究方向的重要課題。

KPC-L006 是由昆藥集團內部在青蒿素的結構上進行結構修飾, 僅在9 號位點進行結構改造合成獲得青蒿素衍生物, 其結構與青蒿素非常類似, 都是具有活性過氧基團的倍半萜內酯類化合物, 也具有相似的生物活性。 青蒿素是一種高效低毒的抗瘧疾藥物, 已成為世界衛生組織推薦治療瘧疾的首選藥物[3]。 近年來, 科學家們發現除抗瘧作用外, 青蒿素類化合物還表現出其他一些生物活性, 如抗寄生蟲, 抗氧化損傷, 抑制血管生成, 免疫抑制, 抗腫瘤作用等。 其中, 青蒿素類化合物的抗腫瘤作用主要表現為: 抑制腫瘤細胞增殖, 誘導腫瘤細胞凋亡, 氧化應激損傷, 阻礙腫瘤細胞血管生成, 抑制腫瘤細胞侵襲和遷移等[4]。 相對于青蒿素類化合物抗瘧疾作用的高效快速, 其抗腫瘤作用略顯遜色, 但作為一種新型的天然藥物來源的抗腫瘤化合物, 其具有巨大的開發潛力, 越來越受到學者們的廣泛關注[5-9]。 目前, 研究較多的青蒿素類化合物主要有青蒿琥酯, 雙氫青蒿素, 蒿甲醚, 蒿乙醚等, 本研究旨在探索KPC-L006 對人肺癌細胞的體外作用。

1 實驗材料與儀器

1.1 細胞株

人肺癌細胞PC9 細胞株, 廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

高糖1640 基礎培養基、 PBS 磷酸緩沖液、 0.25% Trypsin-EDTA、 胎牛血清, 美國Gibco 公司; 青-鏈霉素雙抗液, 德國BI 公司; Annxin V-Alexa Fluor 488/PI 試劑盒, 上海翌圣生物科技股份有限公司; 結晶紫染液、 SDS-PAGE 凝膠試劑盒, 上海碧云天生物技術有限公司; 總蛋白提取試劑盒, 上海貝博生物科技有限公司; BCA 蛋白濃度測定試劑盒, 武漢博士德生物工程有限公司; ECL 化學發光底物, 白鯊生物科技有限公司;Bax 抗體、 Bcl-2 抗體, Abcam; Caspase-3 抗體, GAPDH 抗體, Proteimtech。

1.3 實驗儀器及耗材

BioTek Synergy HT 多功能酶標儀, 美國BioTek 公司; 96 孔細胞培養板, 美國Corning 公司; ChemiDoc-It 2 凝膠成像系統,美國UVP 公司; 超凈工作臺, 二氧化碳培養箱, 美國Thermo Fisher Scientific 公司; XD-202 倒置顯微鏡, 南京江南永新光學有限公司; PVDF 膜, 美國Millipore 公司。

2 實驗方法

2.1 MTS 方法檢測藥物對PC9 細胞細胞活力的影響

待細胞融合度達70%以上, 消化細胞并接種至96 孔板。于培養箱培養細胞至第二天, 取出96 孔細胞培養板, 加入不同濃度的KPC-L006 溶液, 使KPC-L006 在體系內的終濃度為

80 μmol/L, 40 μmol/L, 20 μmol/L, 10 μmol/L, 5 μmol/L,2.5 μmol/L, 每個濃度3 個復孔, 同時設對照組和空白組。 藥物處理24 h, 48 h, 72 h 后, 棄去培養基, 加入含MTS 溶液的新鮮培養基反應1 h 后, 用酶標儀在490 nm 處檢測OD 值。

2.2 劃痕實驗檢測藥物對PC9 細胞劃痕修復率的影響

用黑色標記筆在6 孔板背后, 均勻的劃直線, 每孔穿過3 條直線, 以便確定拍照位置。 取處于對數生長期的細胞, 常規消化后接種于6 孔培養板培養, 接種數量確保過夜后可以長滿。第二天用200 μL 槍頭以直尺為輔助在6 孔板孔底劃出均勻的直線, 盡量垂直于6 孔板背后的橫線。 然后用PBS 清洗細胞3 次, 加入含藥的無血清培養基并分組為: 對照組, 5 μmol/L KPC-L006 組, 10 μmol/L KPC-L006 組, 20 μmol/L KPC-L006組。 分別于劃痕后0 h, 24 h, 48 h 顯微鏡鏡下進行拍照。 拍照后用Image J 計算劃痕面積和劃痕修復率。

2.3 AnnexinV/PI 實驗檢測藥物對PC9 細胞凋亡的作用

取對數生長期的細胞接種于6 孔板, 待第二天細胞貼壁后給予藥物處理并分組為: 對照組, 5 μmol/L KPC-L006 組,10 μmol/L KPC-L006 組, 20 μmol/L KPC-L006 組。 藥物處理48 h 后消化收集細胞, 將細胞用Annxin V-Alexa Fluor 488/PI細胞凋亡檢測試劑盒染料處理后室溫反應15 min, 上流式細胞儀檢測。

2.4 蛋白免疫印跡技術檢測藥物對PC9 細胞凋亡相關蛋白的作用

取對數生長期的細胞接種于6 孔板, 給予藥物處理并分組為: 對照組, 5 μmol/L KPC-L006 組, 10 μmol/L KPC-L006組, 20 μmol/L KPC-L006 組。 加藥48 h 后用PBS 清洗細胞,加入適量RIPA 裂解液冰上裂解細胞30 min 后用細胞刮刀收集細胞裂解液至離心管, 12000 r/min 離心10 min 取上清, BSA法進行蛋白定量。 將不同濃度的蛋白裂解液稀釋調節至等濃度, 100 ℃水浴變性。 制備好的樣品取30 ～40 μg 等量蛋白量上樣, 進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳將蛋白進行分離, 電泳結束后進行冰上轉膜, 將蛋白從凝膠轉移到PVDF 膜, 用5%脫脂牛奶封閉轉印膜上的非特異性蛋白的潛在結合位點, Caspase-3, Bax 和Bcl-2 一抗稀釋液4 ℃孵育過夜, TBST 洗膜, 二抗室溫孵育2 h, TBST 洗膜, 最后,用ECL 發光液進行發光并曝光拍照, 檢測目的蛋白, 采用Image J 進行灰度分析。

3 統計學分析

采用SPSS 21.0 統計軟件進行數據分析, 計量數據以x±s表示, 組間比較采用獨立樣本t檢驗或one-way ANOVA 分析,P＜0.05 表示差異有統計學意義。

4 結 果

4.1 KPC-L006 對PC9 細胞存活率的影響

以MTS 法檢測不同濃度的KPC-L006 對PC9 細胞細胞存活率的影響, 結果見表1。 發現在不同濃度KPC-L006 處理兩種細胞24 h, 48 h, 72 h 后, 兩種細胞的存活率明顯降低, 且細胞存活率隨時間延長和濃度升高而降低, 表明KPC-L006 對PC9 細胞的作用呈一定的時間依賴性和濃度依賴性。 采用GraphPad Prism 8 進行數據擬合計算半數抑制濃度(IC50), KPC-L006 對PC9 細胞48H 的IC50 值為17.53 μmol/L。 總之, KPC-L006 能夠顯著抑制PC9 細胞的細胞活力。

表1 KPC-L006 對PC9 細胞活力的影響Table 1 The effect of KPC-L006 on PC9 cell viability

4.2 KPC-L006 對PC9 細胞遷移的影響

見圖1, 與對照組相比, KPC-L006 處理24 h 和48 h 后PC9 細胞的劃痕修復率明顯減弱(P＜0.05), KPC-L006 濃度越高, 劃痕修復率越低, 劃痕修復率可以很好地反應細胞轉移的能力。 本實驗中, KPC-L006 能夠明顯降低PC9 細胞的劃痕修復率, 說明KPC-L006 能夠抑制PC9 細胞的遷移, 且抑制作用隨濃度升高而增強。

圖1 KPC-L006 對PC9 細胞遷移的影響Fig.1 The effect of KPC-L006 on PC9 cell migration

4.3 KPC-L006 對PC9 細胞凋亡的影響

用Annxin V-Alexa Fluor 488/PI 檢測試劑盒檢測細胞凋亡情況。 細胞凋亡實驗的結果見圖2。 根據流式細胞儀的分析統計結果, 5 μmol/L、 10 μmol/L、 20 μmol/L KPC-L006 處理細胞48 h 后PC9 細胞的凋亡率分別為5.89%, 17.64%, 51%,10 μmol/L、 20 μmol/L KPC-L006 處理后的凋亡細胞明顯大于對照組,P＜0.01 證明KPC-L006 具有能夠促進PC9 細胞凋亡的作用。

圖2 KPC-L006 對PC9 細胞凋亡的影響Fig.2 The ffect of KPC-L006 on apoptosis in PC9 cells

4.4 KPC-L006 對PC9 細胞凋亡相關蛋白的作用

Western blotting 檢測KPC-L006 處理后凋亡相關蛋白水平變化, 分析統計結果見圖3。 本實驗結果表明, KPC-L006 處理PC9 細胞后促凋亡蛋白Caspase-3 的活化明顯上調, Bax 表達水平也隨KPC-L006 的濃度提高而呈上升趨勢; 抗凋亡蛋白Bcl-2 的蛋白水平隨KPC-L006 的濃度提高呈下降趨勢。 該實驗結果表明, KPC-L006 可以刺激PC9 細胞凋亡相關蛋白的表達從而促進細胞凋亡。

圖3 KPC-L006 對PC9 細胞細胞凋亡相關蛋白的作用Fig.3 The effects of KPC-L006 on apoptosis related proteins in PC9 cells

5 結 論

細胞凋亡是指細胞程序性死亡的現象[10], 這對維持一個多細胞生物的組織或器官的完整性和平衡性, 有著不可替代的作用[11]。 調節細胞凋亡的關鍵核心蛋白包括Bcl-2 家族蛋白和Caspase 家族蛋白。 Bcl-2 家族蛋白中, 主要包括Bcl-2 亞家族和Bax 亞家族, Bcl-2 亞家族和Bax 亞家族蛋白對細胞凋亡發揮著相反的作用: Bcl-2 亞家族蛋白基本都具有BH1 和BH2 結構域, 可以阻止細胞的凋亡進程; Bax 亞家族蛋白都具有BH3結構域, 主要起著促細胞凋亡的作用。 Bcl-2 可以和Bax 結合形成異源二聚體, 抑制Bax 的促凋亡作用。 因此, 細胞內Bcl-2 和Bax 的比例決定著細胞對凋亡信號的敏感性[12]。 Caspase家族的蛋白是一種蛋白水解酶, 是啟動細胞程序性死亡的關鍵效應分子, 它們以酶原形態存在于細胞中, 經上游信號剪切活化后發揮其促凋亡作用。 Caspase-3 是Caspase 家族中一種重要的凋亡執行蛋白, 處于整個凋亡信號傳導的下游, Caspase-3被激活后, 細胞凋亡將不可逆轉[13]。 在本研究中, KPC-L006可以明顯提高PC9 細胞的Bax 蛋白水平, 降低Bcl-2 蛋白水平, 使Bax/Bcl-2 的比例升高, 并且調控Caspase-3 的活化水平升高, 從蛋白層面證明了KPC-L006 的促進凋亡的作用。

KPC-L006 作為一種與青蒿素結構非常類似的化合物, 具有良好的抗腫瘤活性。 近年來, 關于KPC-L006 的抗腫瘤作用研究也有許多相關報道。 T. Efferth 等[14]的研究發現, 青蒿琥酯可以誘導線粒體途徑的白血病細胞凋亡。 Bijender Kumar 等[15]的研究發現, 青蒿琥酯可以促進AML 細胞系的ROS 的蓄積、 線粒體膜電位下降, 最終誘導細胞凋亡級聯反應。 美國國家癌癥研究所NCI 對青蒿琥酯在55 種NCI 腫瘤細胞系中的抑制作用進行了測試, 證實了青蒿琥酯對白血病、 結直腸癌、 肺癌、 黑色素瘤等等癌癥細胞都有良好的抗腫瘤作用[16]。 本課題研究了KPC-L006 對肺癌PC9 細胞的細胞增殖, 細胞遷移和細胞凋亡等的作用, 結果表明, KPC-L006 對PC9 細胞48 h 的IC50在17.53 μmol/L, 抑制作用較為顯著, 且在5 μmol/L, 10 μmol/L,20 μmol/L 時均能明顯抑制PC9 細胞的轉移, 顯著提高PC9 細胞凋亡細胞的比例, 促進細胞凋亡, 從而發揮其抗腫瘤作用。

體外實驗證明, KPC-L006 能夠顯著降低人肺癌細胞存活率, 抑制細胞遷移, 促進細胞凋亡, 具有明顯的抗肺癌細胞的作用。 本研究不僅為KPC-L006 在抗腫瘤方面的開發和應用提供了更多理論依據和實驗依據, 也對青蒿素類化合物在抗腫瘤作用方面的研究提供一定的參考, 對尋找出新的高效、 低毒的抗腫瘤藥物具有重要意義。