載阿霉素PEG-PLGA 納米粒的制備及優(yōu)化*

朱站站, 王紹仙, 王亞倫, 李婧煒

阿霉素(doxorubicin, Dox)作為一種臨床上有效的蒽環(huán)類抗腫瘤化療藥物, 能通過與DNA 堿基對之間相互作用并緊密結(jié)合到DNA 上, 進(jìn)而抑制DNA 與RNA 的合成, 對肝癌、 胃癌、乳腺癌、 白血病等多種惡性腫瘤均具有良好的治療效果[1]。 但阿霉素可激活心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激系統(tǒng), 進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)ROS 上升, 引起心肌氧化應(yīng)激損傷、 肌節(jié)蛋白結(jié)構(gòu)破壞等[2-3], 具有明顯的心臟毒性, 嚴(yán)重時(shí)會(huì)進(jìn)一步引起心力衰竭[4]。 這導(dǎo)致阿霉素在臨床應(yīng)用上受到一定的限制, 如何降低阿霉素的體內(nèi)毒副作用, 是提高阿霉素應(yīng)用的關(guān)鍵問題。

近年來, 可生物降解的聚合物如納米粒、 脂質(zhì)體, 等在腫瘤的治療方面被廣泛應(yīng)用[5-6]。 PLGA 是一種可降解的高分子聚合物, 由于其具有良好的生物相容性, 可降解為人體的中間產(chǎn)物乳酸和羥基乙酸, 被廣泛應(yīng)用于藥物載體的制備[7]。 PEG是最常用的納米粒表面改性的親水性化合物, 其不僅具有良好的生物相容性, 而且能夠在血液循環(huán)中有效的阻止納米粒子與血液中蛋白的結(jié)合[8-9], 提高納米粒子在血液中的穩(wěn)定性, 延長納米粒子在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。 本文采用復(fù)乳溶媒蒸發(fā)法制備NP/Dox, 進(jìn)一步對制備工藝進(jìn)行優(yōu)化, 并對NP/Dox 的粒徑、Zeta 電位、 包封率和載藥量進(jìn)行測定, 為阿霉素的臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

BSA124S 電子天平, Sartorius 德國; MS7-H550-Pro 磁力攪拌器, 北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司; SCIENTZ-950E 超聲波細(xì)胞粉碎儀, 寧波新芝生物科技股份有限公司; HC-3018R高速冷凍離心機(jī), 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司; RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀, 上海亞榮生化儀器廠; YR-PTB 循環(huán)水真空泵, 上海亞榮生化儀器廠; SPD-M20A 高效液相色譜儀, 日本島津; Tecnai 透射電子顯微鏡, 美國Fei 公司; Bettersize2600E激光粒度儀, 丹東百特儀器有限公司。

1.2 材料與試劑

Me-PEG-PLGA(MW: 50000), 山東岱罡生物科技有限公司; MAL-PEG-PLGA(MW: 60000)西安瑞禧生物科技有限公司; 膽酸鈉(25 g), 中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; 鹽酸阿霉素(D6900), 北京索萊寶科技有限公司; 二氯甲烷、 乙腈、磷酸、 甲醇均為分析純, 中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; 實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

2 方法結(jié)果與討論

2.1 阿霉素的HPLC 體外含量檢測方法

色譜柱: Dikma Diamonsil C18(5 μm,200 mm×4.6 mm); 流動(dòng)相: 磷酸緩沖液∶乙腈=65∶35; 流速: 1.2 mL/min; 進(jìn)樣量: 20 μL; 檢測器: 島津RF-20A 熒光檢測器; 檢測波長:Ex=467 nm, Em=589 nm; 柱溫: 35 ℃。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

電子天平精密稱取50 mg 的阿霉素于50 mL 的容量瓶內(nèi),加入去離子水溶解后定容作為阿霉素的儲(chǔ)備液(1 mg/mL)。 在10 mL 容量瓶內(nèi), 取適量的阿霉素儲(chǔ)備液分別稀釋為0.01、0.1、 0.5、 1、 5、 10、 50 ng/mL, 分別取上述的不同濃度的阿霉素溶液20 μL 依次進(jìn)行進(jìn)樣分析, 每一濃度重復(fù)進(jìn)樣三次,取峰面積的平均值A(chǔ)。 以HPLC 峰面積A 對阿霉素的濃度C(ng/mL)進(jìn)行線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線C= 0.0031A+0.1969,(R2= 0.9999), 線性范圍為0.01-50 ng/mL。

2.3 NP/Dox 載藥量包封率測定

采用HPLC 測定NP/Dox 的載藥量和包封率, 將NP/Dox 分為兩份, 其中一份用乙腈溶解, 然后加入甲醇稀釋, 按照“2.1” 色譜條件分析納米粒中阿霉素的含量, 另一份冷凍干燥后稱量得到NP/Dox 的總量。 按照以下公式計(jì)算得到NP/Dox的包封率和載藥量。

2.4 NP/Dox 的制備

采用電子天平稱取一定量的Me-PEG-PLGA 和MAL-PEGPLGA 的聚合物材料于1 mL 的二氯甲烷中, 使聚合物材料完全溶解。 向聚合物溶液中加入50 μL 一定濃度的鹽酸阿霉素水溶液, 超聲波細(xì)胞粉碎儀以60 W 的功率冰水浴間斷超聲1 min(超聲3 s, 間斷3 s), 隨后向得到的初乳中加入2 mL 的1 %的膽酸鈉水溶液, 再以固定功率冰水浴間斷超聲一定時(shí)間(超聲3 s, 間斷3 s)。 將超聲得到的乳液滴入20 mL 0.5%的膽酸鈉水溶液中, 磁力攪拌器攪拌10 min, 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶液中的二氯甲烷。 最后通過高速冷凍離心機(jī)收集納米粒(12000 rpm,4 ℃, 1 h), 用超純水清洗三次后冷凍干燥得NP/Dox。

2.5 超聲功率的優(yōu)化

按照Me-PEG-PLGA 和MAL-PEG-PLGA 的質(zhì)量比為9∶1稱取聚合物總量為25 mg, 超聲的時(shí)間為1 min, 阿霉素的投料量為0.5 mg, 超聲的功率分別為80 W、 100 W、 120 W、 160 W,按照“2.4” 方法制備NP/Dox, 利用激光粒度儀測定其粒徑和Zeta 電位, 考察超聲功率對NP/Dox 的粒徑影響。 如表1 所示,隨著超聲功率的增大NP/Dox 的粒徑逐漸減小, 粒徑大小不僅影響納米粒的載藥量同時(shí)還影響著納米粒在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。 納米粒的粒徑過大會(huì)降低細(xì)胞的吞噬效率, 不利于納米粒載體將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至病灶部位。 當(dāng)超聲功率達(dá)到160 W 時(shí)在超聲過程中出現(xiàn)沸騰現(xiàn)象, 致使超聲不均勻, 出現(xiàn)明顯分層現(xiàn)象, 因此選擇超聲功率為120 W。

表1 超聲功率對NP/Dox 粒徑和電位的影響Table 1 Effect of ultrasonic power on NP/Dox particle size and Zeta potential

2.6 超聲時(shí)間的優(yōu)化

按照Me-PEG-PLGA 和MAL-PEG-PLGA 的質(zhì)量比為9 ∶1稱取聚合物總量為25 mg, 超聲的功率為120 W, 阿霉素的投料量為0.5 mg, 超聲時(shí)間分別為0.5 min、 1 min、 2 min。 按照“2.4” 方法制備NP/Dox, 利用激光粒度儀測定其粒徑和Zeta電位, 考察超聲時(shí)間對NP/Dox 的粒徑影響。 如表2 所示, 當(dāng)超聲時(shí)間為0.5 min 時(shí)NP/Dox 的粒徑為178 nm 左右, 當(dāng)超聲時(shí)間為1 min 和2 min 時(shí)NP/Dox 的粒徑為165 nm 左右。 當(dāng)超聲時(shí)間為1 min 時(shí)NP/Dox 的Zeta 電位為-35 mV 左右, 更有利于保持納米的穩(wěn)定。 因此選擇超聲時(shí)間為1 min。

表2 超聲時(shí)間對NP/Dox 粒徑和電位的影響Table 2 Effect of ultrasonic time on NP/Dox particle size and Zeta potential

2.7 聚合物的總量的優(yōu)化

按照Me-PEG-PLGA 和MAL-PEG-PLGA 的質(zhì)量比為9 ∶1稱取聚合物總量為10 mg、 25 mg 和50 mg, 超聲的功率為120 W, 超聲時(shí)間為1 min, 阿霉素的投料量為0.5 mg, 按照“2.4” 方法制備NP/Dox, 利用激光粒度儀測定其粒徑和Zeta電位, 考察聚合物總量對NP/Dox 的粒徑影響。 結(jié)果如表3 所示, 隨著聚合物總量的增加, 納米粒的粒徑明顯增加。 納米粒的粒徑過大不利于藥物的轉(zhuǎn)運(yùn), 當(dāng)納米粒載體的粒徑過小會(huì)大大降低納米遞藥系統(tǒng)的載藥量。 因此我們優(yōu)化選擇聚合物總量為25 mg。

表3 聚合物總量對NP/Dox 粒徑和Zeta 電位的影響Table 3 Effect of total polymer on NP/Dox particle size and Zeta potential

2.8 阿霉素的投料量與聚合物總量的比例優(yōu)化

按照Me-PEG-PLGA 和MAL-PEG-PLGA 的質(zhì)量比為9 ∶1稱取聚合物總量為25 mg, 超聲的功率為120 W, 超聲時(shí)間為1 min, 分別稱取0.5 mg、 1.0 mg 和1.5 mg 的阿霉素, 按照“2.4” 中的方法制備NP/Dox, 考察阿霉素的投料量與聚合物總量的質(zhì)量比對NP/Dox 的載藥量和包封率的影響。 結(jié)果如表4 所示, 阿霉素的投料量與聚合物總量的質(zhì)量比為4%和6%時(shí), 其包封率偏低, 藥物的損失偏多, 當(dāng)阿霉素的投料量與聚合物總量的質(zhì)量比為2%時(shí), 其藥物的包封率為68.3%左右,藥物的利用率高, 因此選擇Dox 的投料量與聚合物總量的質(zhì)量比為2%。

表4 阿霉素投料量與聚合物總量的質(zhì)量比對NP/Dox 的載藥量和包封率的影響Table 4 Effects of mass ratio of doxorubicin to total polymer on NP/Dox drug loading content and encapsulation efficiency

2.9 NP/Dox 的粒徑和Zeta 電位的測定

按照優(yōu)化后的條件制備NP/Dox, 采用去離子水將NP/Dox稀釋。 采用激光粒度儀測定NP/Dox 的粒徑和Zeta 電位, 如表5、 圖1、 圖2 所示, NP/Dox 的粒徑為161.4 nm 左右, Zeta電位為-37.1 mV 左右。

表5 NP/Dox 的粒徑和Zeta 電位Table 5 The particle size and Zeta potential of NP/Dox

圖1 NP/Dox 的粒徑分布圖Fig.1 The particle size distribution of NP/Dox

圖2 NP/Dox 的Zeta 電位分布圖Fig.2 The Zeta potential distribution of NP/Dox

3 結(jié) 論

本研究通過復(fù)乳溶媒蒸發(fā)法成功制備了NP/Dox。 進(jìn)一步優(yōu)化超聲功率、 超聲時(shí)間、 聚合物總量對NP/Dox 粒徑的影響,阿霉素的投料量對NP/Dox 載藥量和包封率的影響, 確定了超聲功率為120 W、 超聲時(shí)間為1 min、 聚合物總量為25 mg, 阿霉素與聚合物的質(zhì)量比為2%。 最終制備得到NP/Dox, 粒徑在161 nm 左右, PDI 在0.05 左右, Zeta 電位為-37.1 mV 左右,并具有較好的穩(wěn)定性。