馬錢子總堿脂質液晶納米粒的制備及工藝優化*

喻龍江, 王曉慧, 劉婉婷, 謝 驥, 李海平

馬錢子為馬錢科植物馬錢(Strychnos nμx ～vomica Linn. )的干燥成熟種子, 馬錢子性味苦, 性溫, 歸肝、 脾經, 有大毒,有散結消腫、 通絡止痛之功效[1], 馬錢子主要有效成分為生物堿, 馬錢子總堿(馬錢子堿和士的寧)占總生物堿的85 %以上[2-3]。 研究發現, 馬錢子堿不僅能增加嗎啡的鎮痛作用, 還能延長其鎮痛時間[4], (因士的寧鎮痛較弱且毒性較強沒有進行考察)無成癮性。 因安全范圍窄小, 《中國藥典》收載的劑型甚少, 影響了其在臨床上的使用。 以脂質體為載體的藥物以其獨特的靶向性、 緩釋性受到研究者的關注[5-6]。

硫酸銨梯度主動載藥技術利用藥物對硫酸銨電離形式的依耐性, 以電中性形式跨越脂質雙層, 而非電離形式, 通過形成脂質體膜內、 外水相pH 值差異, 促使外水相藥物自發向脂質體內部聚集, 從而獲得較高的藥物包封率[7]。 本研究考察硫酸銨梯度主動載藥技術制備馬錢子脂質體的可行性, 為其外用納米經皮制劑開發提供理論參考。

1 儀器和試藥

1.1 儀 器

Agilent 1220 Serie 高效液相色譜儀, 美國安捷倫公司; RE-52 旋轉蒸發儀, 上海亞榮生化; Zetasizer Nano ZSP 納米粒度電位儀, 英國馬爾文; FEI 透射電子顯微鏡(美國); HL-2S 恒流泵, 上海滬西分析儀器廠有限公司; PHS-3C 型pH 計, 上海精科; LF-1 脂質體擠出儀, Avestin 公司; FA25 型高速剪切機, FLUKO 公司。

1.2 試 藥

馬錢子總堿粉末(自制, 其中馬錢子總生物堿占85.06%,含馬錢子堿約為21.87%); 馬錢子堿對照品(中國生物制品檢定所, 編號110705); 大豆卵磷脂、 膽固醇(分析純), 中國慧興生化試劑有限公司; Sephadex G-50, Pharm a-cia 公司; 其他試劑均為分析純或色譜純, 水為超純水。

2 方法與結果

2.1 馬錢子總堿脂質體的制備

精密稱取處方量的卵磷脂、 膽固醇(質量比6 ∶1)溶于14 mL 無水乙醇中, 超聲至完全溶解, 以5 mL/min 速度注入磁力攪拌中預熱的硫酸銨溶液(濃度0.2 mol/mL)中, 60 ℃水浴減壓旋蒸除去乙醇, 孵化15 min, 用20 倍pH 7.4 磷酸鹽緩沖溶液(PBS)透析除去外水相硫酸銨, 高速剪切2 遍, 每遍1 min, 脂質體擠出儀擠出, 冷卻至室溫, 制得空白脂質體。 取空白脂質體加入等量2.0 mg/mL 馬錢子堿PBS 溶液, 60 ℃水浴恒溫磁力攪拌3 min, 即得LLSN。

2.2 馬錢子堿的含量測定方法

2.2.1 標準曲線的繪制

稱取馬錢子堿標準品20 mg, 置100 mL 容量瓶中, 加甲醇溶解后稀釋至刻度, 得到濃度為200 μg/mL 標準品儲備液。 精密吸取標準品儲備液0.5、 1、 2、 3 和4 mL 于10 mL 容量瓶中,用定容至刻度, 得到濃度為10 ～80 μg/mL 的梯度標準溶液。用甲醇溶液作為參比, 262 nm 波長測定吸光度A。 以吸光度A為縱坐標, 濃度C 為橫坐標, 繪制標準曲線, 見圖1, 回歸方程為A=0.0002C+0.0046, R2= 0.9993。

圖1 馬錢子堿標準曲線Fig.1 Standard curve of strychnine

圖1 顯示, 馬錢子堿標準溶液濃度在10 ～80 μg/mL 范圍內線性關系良好。

2.2.2 精密度實驗

分別取一定濃度對照品溶液, 連續測定6 次, 記錄吸光度A, 結果RSD(n=6)為0.47%, 方法精密度良好。

2.2.3 穩定性實驗分別在第0、 2、 4、 8 、 12、 24 h 分別測定同一供試品溶液,記錄吸光度A, 結果RSD(n=6)為0.89%, 方法穩定性良好。

2.2.4 重復性試驗

取同一批供試品6 份, 連續測定6 次, 記錄吸光度A,RSD 值(n=6)為0.43%, 方法的重復性良好。

2.2.5 加樣回收實驗

在含有20.21 μg 的供試液中, 按照50%、 100%、 150%的比例(低、 中、 高)加入相應量的標準溶液, 測定吸光度A,計算含量。 實驗結果見表1。

表1 加樣回收率結果(n=3)Table 1 Recovery rate (n=3)

表1 結果顯示, 平均回收率為100.16%、 RSD 為0.38%,方法穩定性好、 準確度高。

2.3 馬錢子堿包封率的測定

采用葡聚糖凝膠柱法[7]。

2.3.1 脂質體洗脫曲線的繪制

取脂質體適量, 分別用PBS 和破膜劑(異丙醇∶無水乙醇=4 ∶1)經Sephadex G-50 柱進行恒速洗脫, 流速2 mL/min, 每次2 mL, 共15 次, 以PBS 和破膜劑等量混合為參比, 262 nm處測定吸光度A, 繪制洗脫曲線, 見圖2。

圖2 脂質體洗脫曲線Fig.2 Elution curve of total base nanoliposomes from strychnine

2.3.2 脂質液晶納米粒包封率測定

依據洗脫曲線分別收集前10 mL 含藥脂質體洗脫液和后18 mL 游離藥物的洗脫液進行含量測定, 計算脂質體中包封藥物含量和游離藥物含量, 計算包封率(1)。

包封率=[脂質體中藥物含量/(脂質體中藥物含量+游離藥物含量]×100% (1)

2.4 馬錢子堿納米脂質體制備方法的篩選

分別選用逆向蒸發法、 薄膜分散法、 乙醇注入-硫酸銨梯度法等3 種方法制備馬錢子堿脂質體, 結果見表2。

表2 不同制備方法包封率和成形性結果Table 2 Encapsulation efficiency and formability results of different preparation methods

表2 結果顯示, 乙醇注入-硫酸銨梯度法明顯優于其他兩種方法, 可以作為優選制備方法。

2.5 正交設計優化LLCN 制備工藝

2.5.1 單因素分析

初步選定四個影響因素(A、 B、 C、 D)四水平進行單因素分析, 確定因素的響應值。 因素-水平表見表3, 各因素對馬錢子堿包封率的影響, 實驗結果見圖3。

表3 因素-水平表(單因素分析)Table 3 Factors-level table (single factor analysis)

圖3 各因素對包封率的影響結果Fig.3 Influence of various factors on encapsulation rate

圖3 結果顯示, 單因素分析預測各因素最優相應點為(A)磷脂-膽固醇比6 ∶1、 (B)藥-脂比為10 ∶1、 (C)乙醇的體積12 mL/100 g、 (D)方差項。

2.5.2 正交設計優化處方因素

因素與水平表見表4, 實驗結果見表5, 方差分析見表6。

表4 因素與水平L9(34)表(正交設計實驗)Table 4 Factors and level L9(34) table(orthogonal design experiment)

表5 正交設計實驗結果Table 5 Experimental results of central composite response surface design

表6 正交實驗方差分析結果Table 6 Results of variance analysis of orthogonal experiment

通過直觀分析最優處方方案為A2B2C3, 其主次影響因素的順序為C＞A＞B; 正交設計結果與直觀分析相符, 主體間效應檢驗差異顯著(P＜0.05 或P＜0.01)。 磷脂∶膽固醇比為6 ∶1、脂-藥比為10 ∶1、 乙醇的體積為12 mL/100 g 時為最優方案。

2.5.3 驗證性實驗

按照A2B2C3方案, 平行制備3 份, 包封率結果見表7。

表7 驗證性實驗結果(n=3)Table 7 Confirmatory experimental results(n=3)

表7 顯示, 正交設計優化的提取工藝穩定可靠, 質量可控。

2.6 脂質體粒徑測定和表征觀察

采用Zeta 電位粒度測定儀, 超純水為分散介質測定馬錢子總堿脂質體的平均粒徑為156±10.21 nm, 見圖5。 用透射電子顯微鏡觀察并拍攝照片, 馬錢子總堿脂質體的掃描電鏡圖見圖6。 馬錢子總堿脂質體成球形, 形態完整, 分界明顯。

圖5 脂質體粒徑分布圖Fig.5 Size distribution of liposomes

圖6 脂質體掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron microscopy of liposomes

3 結 論

(1)硫酸銨梯度法是利用硫酸銨溶液為水相, 制備內外均含有硫酸銨的脂質體, 然后洗掉外相的硫酸銨, 從而形成脂質體內外硫酸銨的濃度梯度。 硫酸銨溶液水解后, 在內水相中,易分解成NH3+H+, 這是產生pH 動力的主要原因, 不同離子對雙分子層滲透性能的貢獻有如下規律, 即(NH4)2SO4＜而NH3不斷地從脂質體內相的離去, 導致內外相H+的濃度梯度。 馬錢子堿為弱堿性藥物, 進入內水相后, 遇到酸性環境后變成離子態, 返回外水相就受到了阻礙, 另一方面, 在溢出的NH3作用下(40 ～50 ℃溫孵時為液晶態), 馬錢子堿脂性增強而進入內水相與硫酸成鹽, 保留在內水相, 使得其包封率大大高于被動載藥, 但此法也僅限于弱堿性藥物[8-9]。 有文獻報道[10], 硫酸銨濃度對包封率影響顯著,我們也觀察到內水相隨著硫酸銨溶液的濃度的逐漸增大, 包封率也隨著增大, 但會有飽和趨勢, 到達最大值后包封率會略有下降。

(2)關于處方因素中交互影響比較強烈, 正交設計實驗預測的最佳提取參數與驗證性結果相符。

(3)脂質體粒徑的大小和Zeta 電位的研究, 是非均相體系穩定性考察的常規項目, 在防止脂質體微粒聚集、 融合, 以及脂質體與藥物之間的作用方面有一定的作用。 我們通過高速剪切和擠出儀擠出的方法, 控制剪切次數和擠出孔徑, 脂質體的穩定性獲得了大大提高。