lncRNA PART1通過miR-204-3p/IGFBP2軸促進非小細胞肺癌的實驗研究

陳建廣 王芳 王秀云

肺癌是臨床上常見的惡性腫瘤，全球范圍內發病率和死亡率排在首位[1]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌常見的病理類型，約占肺癌的85%[2]。肺癌的發病機制目前尚未完全明確，雖然近年來肺癌的研究取得了重大進展，但是患者5年生存率仍未見明顯提高[1]。深入分析肺癌的發病機制并探尋潛在的分子生物學指標對其早期診斷和治療有重要意義。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在表觀遺傳學和免疫調控等細胞生物學行為中起到重要作用，對腫瘤的早期診斷、療效和預后評價有一定價值[3-4]。前列腺雄激素調節轉錄本1(prostate androgen-regulated transcript 1，PART1)是近年來發現的一種新的lncRNA，在多種癌癥中高表達，可能發揮促癌基因作用[5-7]。PART1在肺癌中的作用機制既往報道較少，值得深入分析。

lncRNA與微小RNA(micro RNA)的相互調控關系在腫瘤的發生和發展中扮演著重要角色。miR-204-3p與腫瘤細胞的增殖、侵襲和凋亡密切相關，胰島素樣生長因子結合蛋白2(insulinlike growth factor binding protein-2，IGFBP-2)是其作用靶點[6]。既往研究顯示，IGFBP-2可能是NSCLC的生物學標志物[7]，因此可以推測miR-204-3p/IGFBP-2可能參與了NSCLC進展。前期我們用Starbase軟件預測到miR-204-3p與PART1有結合位點，并且驗證了miR-204-3p與IGFBP-2也有結合位點，我們猜測，PART1可能通過miR-204-3p/IGFBP2軸參與肺癌的進展。本研究通過體外細胞研究和動物研究對PART1在NSCLC中的作用進行分析，并探討其作用機制。

資料與方法

一、實驗材料

NSCLC細胞系(A549、H1299、H1650、H1975和PC9)和人正常支氣管上皮細胞系(HBE)均購于中科院上海細胞庫。10只4周齡雄性BALB/c裸鼠(18—20g)購于遼寧長生生物技術有限公司[SCXK(遼)2017-0011]，使用許可證號[SYXK(魯)2017-0023])。胎牛血清、改良伊格爾培養基(Dulbecco modified Eagle medium, DMEM)培養基、反轉錄試劑盒和2×SYBR Green PCR Mastermix試劑盒購于北京邁瑞達科技有限公司。PCR引物由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司設計并提供，CCK-8試劑盒和Transwell小室購于蘇州宇恒生物科技有限公司，LipofectamineTM 2000購于美國Invitrogen 公司，shRNA-PART1、miR-204-3p inhibitor和攜帶有IGFBP-2全基因的過表達重組載體pcDNA-IGFBP-2以及對照空載體pcDNA均購自上海吉瑪制藥技術有限公司。戊巴比妥購自上海信裕生物科技有限公司，18F-FDG購自北京善為正子醫藥技術有限公司。本實驗方案通過東營市人民醫院動物倫理委員會審核批準(IACUC:20170826007)。

二、細胞培養

將細胞置于含10%胎牛血清、鏈霉素100 μg/mL及青霉素100 U/mL的DMEM培養基中進行培養，培養條件為37℃、5%CO2。當細胞融合度達80%時進行傳代。

三、RT-PCR檢測細胞中PART1相對表達量

用TRIzol法提取細胞總RNA，用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。隨后用PCR試劑盒，以cDNA為模板進行PCR反應，反應條件為95℃ 10min、95℃ 30s、60℃ 15s、72℃ 20s，共計40個循環。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。內參為GAPDH，用2-△△Ct法計算PART1基因相對表達量。

四、抑制PART1對NSCLC細胞增殖、侵襲和遷移的影響

1 轉染 用LipofectaminETM 2000試劑轉染A549細胞：首先制備LipofectamineTM 2000復合物和DNA復合物(每孔含4μg濃度為1 μg/μL的質粒和246 μL的無血清培養基)，混勻后靜置20 min。將混合物加入細胞培養板，培養48h。將細胞分為sh-NC組和sh-PART1組，轉染24 h后進行后續實驗。

2 CCK8法和克隆形成實驗檢測細胞增殖 CCK-8法：用CCK-8試劑盒檢測A549細胞活性，細胞培養24 h、48 h、72 h和96 h時加入CCK-8試劑。用酶標儀處讀取490nm處吸光度值。克隆形成實驗：用胰蛋白酶消化轉染后的A549細胞，培養3周。當出現癌細胞克隆時停止培養。用4 %多聚甲醛進行固定，30 min后用結晶紫染色，計算克隆細胞數目。細胞樣本設置4個復孔，實驗重復4次。

3 Transwell檢測細胞侵襲 在Transwell遷移板上室鋪基質膠，隨后將A549細胞接種于Transwell小室；下室中加入含10%胎牛血清培養基。培養48h后取出Transwell小室，用多聚甲醛固定黏附于下室微孔膜下面的細胞，用結晶紫染色15min，干燥后在顯微鏡(放大200倍)下取5個視野進行觀察，計算平均侵襲細胞數。細胞樣本設置4個復孔，實驗重復4次。

4 體外損傷愈合實驗檢測細胞遷移 取對數生長期A549細胞，接種于細胞培養板中，當細胞融合度達80%時用無菌槍頭進行劃痕。培養0h、24h時用顯微鏡拍照，損傷愈合率(%)=(0h劃痕寬度-24h劃痕寬度)/0h劃痕寬度×100%。

5 抑制PART1對裸鼠腫瘤增殖的影響 10只BALB/c裸鼠飼養于本院動物中心，隨機分為sh-NC組和sh-PART1組，每組5只，自由進食和水。取對數生長期A549細胞，調整濃度為1×107個/mL。無菌條件下，將BALB/c裸鼠固定，將0.2 mL含有瘤細胞的培養基進行右側前肢腋下接種，建立腫瘤模型[8]。注射后第6天起，每3天測量1次腫瘤體積，用游標卡尺測量腫瘤的長徑(a)和短徑(b)，腫瘤體積=1/2ab2[9]。

6 PART1、miR-204-3p和IGFBP2靶向作用關系的驗證 用雙熒光素酶報告基因實驗進行靶向關系驗證。(1)將PART1候選靶基因miR-204-3p 3’UTR靶序列插入螢火蟲熒光素酶基因下游。將重組表達載體pcDNA-EGFP-pre-PART1和miR-204-3p驗證載體pmir-GLO-PART1-miR-204-3p 3’UTR共轉染至A549細胞中，設置空質粒載體、PART1過表達載體共轉染對照組。轉染步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，轉染后48h用酶標儀檢測螢火蟲和海腎(內參)熒光值。(2)將miR-204-3p的候選靶基因IGFBP2 3’UTR靶序列插入螢火蟲熒光素酶基因下游。隨后重組表達載體pcDNA-EGFP-pre-miR-204-3p與IGFBP2驗證載體pmir-GLO-miR-204-3p-IGFBP2 3’UTR分別共轉染到A549細胞，另外設置空質粒載體、miR-204-3p過表達載體共轉染對照組。轉染48h后檢測螢火蟲和海腎(內參)熒光值。

7.PART1通過miR-204-3p/IGFBP2軸對細胞增殖、侵襲和遷移的影響 將A549細胞分為NC組(轉染NC質粒)、PART1 shRNA組(僅轉染shRNA-PART1)、PART1 shRNA+miR-204-3p inhibitor組(同時轉染shRNA-PART1和miR-204-3p inhibitor)、shRNA-PART1+IGFBP2組(同時轉染PART1 shRNA和過表達重組載體pcDNA-IGFBP2)，轉染步驟嚴格按照試劑盒說明書操作，轉染48 h后檢測IGFBP2 mRNA和蛋白的表達水平、細胞增殖、侵襲和遷移能力，實驗重復4次。蛋白表達水平檢測用Western-blot法，大致步驟：用RAPI裂解液提取細胞中總蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，10%SDS-PAGE分離蛋白，用半干法將蛋白轉至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2h，加入抗IGFBP2(1∶1000)4℃過夜孵育，次日除去一抗，用TBST緩沖液洗滌3次后加入二抗(羊抗兔，1∶500)，封閉1h。以GAPDH作為內參，用ECL發光儀對蛋白成像，用Image J軟件分析灰度值。

五、統計學方法

結 果

一、PART1在NSCLC細胞中的表達

與HBE細胞比較，A549、H1299、H1650、H1975和PC9細胞中PART1相對表達量明顯較高(P<0.05)(見圖1)。

圖1 PART1在NSCLC細胞中的表達水平

以GAPDH為內參基因，與HBE細胞比較，*P<0.05

二、敲降PART1表達對A549細胞增殖、侵襲和遷移的影響

用克隆形成實驗和CCK-8實驗檢測細胞增殖，Transwell實驗檢測細胞侵襲力，體外損傷愈合實驗檢測細胞遷移力。sh-PART1組PART1相對表達量、細胞增殖力、侵襲力和遷移力明顯低于sh-NC組(P<0.05)(見圖2)。

圖2 敲降PART1表達對A549細胞增殖、侵襲和遷移的影響

三、抑制PART1對裸鼠腫瘤增殖的影響

右側前肢腋下接種A549細胞，制備腫瘤模型。在動物實驗中，重復測量方差分析結果顯示，sh-NC組腫瘤體積隨時間的增加程度高于sh-PART1組(P<0.05)。第21d時，sh-NC組腫瘤重量大于sh-PART1組(P<0.05)(見圖3)。sh-PART1對腫瘤的抑制率為59.87%。

圖3 抑制PART1對裸鼠腫瘤增殖的影響

四、PART1靶向調控miR-204-3p介導IGFBP2在癌細胞中的表達

用Starbase軟件預測到miR-204-3p與IGFBP2有結合位點。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，過表達miR-204-3p使熒光素酶活性下降(P<0.05)。PART1敲低可以促進miR-204-3p的表達(P<0.05)。IGFBP2基因與miR-204-3p也有結合位點。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，過表達miR-204-3p使熒光素酶活性下降(P<0.05)。抑制miR-204-3p可促進IGFBP2 mRNA的表達(P<0.05)(見圖4)。

圖4 PART1與miR-204-3p/IGFBP2軸的調控關系驗證

五、敲降PART1通過上調miR-204-3p/IGFBP2軸對癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響

與NC組相比，敲降PART1表達可以明顯抑制細胞中IGFBP2 mRNA和蛋白的表達水平(P<0.05)(見圖5)。同時，轉染PART1 shRNA+miR-204-3p-inhibitor或者PART1-shRNA+ IGFBP2過表達載體后，IGFBP2 mRNA和蛋白的表達水平較PART1 shRNA組明顯上調(P<0.05)。敲降PART1可顯著抑制細胞的增殖、侵襲和遷移(P<0.05)。同時敲降miR-204-3p或過表達IGFBP2則下調了敲降PART1對細胞的抑制作用(P<0.05)(見圖5，6)。以上說明，敲降PART1可通過上調miR-204-3p/IGFBP2軸抑制癌細胞的增殖、侵襲和遷移。

圖5 PART1和miR-204-3p對IGFBP2基因和蛋白表達的影響

圖6 敲降PART1通過上調miR-204-3p/IGFBP2軸對癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響

討 論

NSCLC嚴重威脅了人類生命健康，深入探討其發病機制具有重要意義。lncRNA可以靶向作用于miRNA，進而調控下游靶基因，參與腫瘤的發生和發展[10]。PART1定位于5q12上，最早被發現在前列腺中表達，可以調節雌激素受體基因的表達，參與前列腺癌的發生[11]。后來，越多越多研究證實，PART1與乳腺癌[12]、宮頸癌[13]、膠質瘤[6]和肝細胞癌[14]等多種腫瘤的進展密切相關。PART1在NSCLC中的作用及其機制，既往報道較少。本研究發現，與HBE細胞比較，A549、H1299、H1650、H1975和PC9細胞中PART1相對表達量明顯較高。Zhu等[15]也發現，NSCLC細胞A549、H1650、SK-MES-1和H1975中PART1相對表達量高于HBE細胞。以上提示，PART1可能參與了NSCLC的發生。

本研究結果顯示，下調PART1基因表達可以明顯抑制A549細胞的增殖、侵襲和遷移。在動物研究中，抑制PART1的表達可以明顯降低腫瘤的體積和重量。說明PART1可能參與NSCLC的進展。PART1參與腫瘤進展的機制比較復雜，Sun等[16]發現PART1可以調控Toll樣受體通路影響前列腺癌細胞的增殖和凋亡。PART1主要通過調控miRNA/mRNA網絡參與腫瘤進展。PART1可以通過miR-150-5p/miR-520h/CTNNB1通路和Wnt/β-catin通路促進結腸癌細胞的增殖和侵襲[17]；能通過miR-4516信號通路促進乳腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移[12]。

本課題組用生物信息學技術預測到miR-204-3p與PART1有結合位點，miR-204-3p和IGFBP2有結合位點，隨后雙熒光素酶報告基因實驗結果予以證實。miR-204-3p在腫瘤中可能發揮抑癌作用[18-19]。miR-204-3p與IGFBP2的調控關系既往已被證實，Chen等[20]發現，miR-204-3p可以靶向作用于IGFBP2，參與膠質瘤細胞的增殖和凋亡。IGFBP2參與了NSCLC的進展，與淋巴結轉移、局部侵犯、TNM分期、遠處轉移和耐藥等密切相關[21-22]。本研究轉染PART1 shRNA+miR-204-3p-inhibitor或者PART1-shRNA+ IGFBP2過表達載體后，IGFBP2 mRNA和蛋白的表達水平較PART1 shRNA組明顯上調。敲降PART1可顯著抑制細胞的增殖、侵襲和遷移。同時敲降miR-204-3p或過表達IGFBP2則下調了敲降PART1對細胞的抑制作用，說明敲降PART1可通過上調miR-204-3p/IGFBP2軸抑制癌細胞的增殖、侵襲和遷移。

綜上，PART1在NSCLC細胞中高表達，可通過調控miR-204-3p/IGFBP2軸促進癌細胞增殖、侵襲和遷移。PART1有望為診治NSCLC提供一個潛在靶點，未來需要分析PART1與NSCLC臨床病理特征及預后的關系，并探尋PART1早期診斷NSCLC的價值。