綿羊肌內前體脂肪細胞CNR1和FABP4基因表達研究

閆偉， 王玉濤， 張永浩， 劉海霞*， 韓大勇， 朱愛文

（1.江蘇農牧科技職業學院動物科技學院，江蘇 泰州 225300；2.喀什大學生命與地理科學學院，新疆帕米爾高原生物資源與生態自治區重點實驗室，新疆 喀什 844000）

在羊肉產量滿足人們需求的同時，肌內脂肪（intramuscular fat，IMF）含量高的羊肉更受消費者青睞[1-2]。IMF反映了動物肌內脂肪沉積能力，目前IMF是評價羊肉質性狀的重要指標之一，IMF含量的高低直接影響羊肉的風味、嫩度、適口性及多汁性[3-4]，決定了羊肉的商品特性和養殖戶的經濟收益。為了滿足消費者對高質量羊肉制品的需求，研究調控羊肉IMF含量的生物學機制逐漸成為近年來的研究熱點。

研究發現，動物脂肪沉積部位包括皮下、內臟組織周圍、肌肉群之間、肌纖維束間（肌內脂肪）和肌纖維內脂肪，且不同部位脂肪含量存在差異，皮下和肌間脂肪約占30%，肌內脂肪約占1%[5]。動物肌內脂肪沉積表現為肌內脂肪細胞的增殖和肥大[6]，通常肌內脂肪細胞以簇的形式聚集，起初為前體脂肪細胞增殖，進而前體脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞[7]。目前，山羊、綿羊及多種動物體內均能夠分離和培養前體脂肪細胞，通過前體脂肪細胞模型開展綿羊脂肪沉積研究具有較大優勢。

綿羊脂肪沉積過程受多種基因調控。大麻素受體 1（cannabinoid receptor 1)基因 CNR1主要表達于腦、脊髓、脂肪、肌肉和肝臟組織[8-9]，其功能蛋白CB1受體與內源性大麻素組成的內源性大麻素系統（endogenows cannabinoid system，ECS）在動物整體能量代謝[10]和脂肪代謝中發揮核心作用[11-13]。脂肪酸結合蛋白4（fatty acid binding protein 4）基因FABP4在脂肪細胞分化期間高表達，能夠結合和轉運長鏈脂肪酸，在甘油三酯合成和分解中具有重要作用。FABP4基因高表達有利于長鏈脂肪酸跨膜轉運[14]及肌肉組織對脂肪酸的吸收[15-16]。本研究前期通過分析采集的17個綿羊半同胞家系生長和胴體數據發現，綿羊FABP4基因變異與IMF含量等表型性狀顯著相關[17]，推測FABP4基因變異可能影響FABP4蛋白，進而影響綿羊肌內脂肪沉積。轉錄因子c-Jun和活化蛋白-1（activator protein-1，AP-1）形成的異源二聚體影響小鼠FABP4基因轉錄及表達[18]，且轉錄因子c-Jun受細胞內c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）調控。研究發現，小鼠中激活的CB1受體同樣能夠作用于細胞內激酶JNK調控轉錄因子c-Jun，從而影響細胞功能[19]，由此表明，CNR1基因與FABP4基因間可能存在互作。

目前，前人主要對羊肌內前體脂肪細胞分化基因的表達開展研究，杜琛等[20-21]和鄭竹清等[22]對絨山羊肌內前體脂肪細胞開展基因表達、轉錄組和LncRNA分析；崔京京等[23]和羅燕等[24]對綿羊肌內前體脂肪細胞開展分離培養及誘導分化；李戡等[25]對綿羊肌內前體脂肪細胞分化的腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）調控作用開展研究。但關于調控綿羊肌內脂肪沉積基因表達的研究非常有限。因此，本研究利用綿羊肌內前體脂肪細胞，欲揭示CNR1和FABP4基因的表達特征及差異，為進一步研究CNR1和FABP4基因間調控關系提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試動物 采購3日齡湖羊羔羊一只，羔羊全身用75%醫用酒精消毒后屠宰，無菌條件下快速采取羔羊背最長肌組織保存于含100 U雙抗（青霉素和鏈霉素）的無菌磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）中備用。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養基、0.25%的胰蛋白酶、PBS緩沖液和青霉素、鏈霉素購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自北京政博偉業生物科技有限公司，Ⅱ型膠原酶、胰島素、地塞米松和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤購自默克化工技術（上海）有限公司，油紅O染液購自北京索萊寶科技有限公司。RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒購自寶日醫生物技術（北京）有限公司，Light Cycler 480 SYBR Green I Master購自瑞士羅氏公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 肌內前體脂肪細胞的分離及傳代培養 3日齡湖羊羔羊背部切取倒數第2和第3肋骨間背最長肌組織，用含雙抗的PBS沖洗最少3遍后移入超凈工作臺，無菌操作下用外科手術剪剔除背肌組織肉眼可見的血管和結締組織，小心分離肌束膜，置于50 mL離心管中用PBS液懸浮，1 500 r·min離心5 min后去除PBS。加入0.2%的Ⅱ型膠原酶在37℃水浴鍋中振蕩消化90 min，加入等體積的消化終止液（10%FBS+DMEM）終止消化，2 500 r·min-1離心10 min后棄上清液。加入2 mL完全培養基（10%FBS+DMEM+雙抗）重懸細胞，先后利用100和40 μm的無菌細胞篩過濾細胞。濾液2 000 r·min-1離心5 min后棄上清，沉淀加入含10%FBS的完全培養基懸浮細胞，然后將細胞接種于培養皿在37℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中培養。細胞在培養2 h后進行觀察，見少量細胞貼壁后即將未貼壁細胞培養基轉移接種至新的培養皿。新培養皿中細胞在培養2.5 h后棄培養液，應用新鮮培養液沖洗貼壁細胞2次后繼續培養，每3 d換1次培養液，連續培養5～7 d。原代細胞長到80%～90%豐度時用0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例進行傳代培養，每隔2 d換1次培養液，細胞長到80%豐度后繼續傳代培養。

1.2.2 肌內前體脂肪細胞生長曲線測定 原代細胞鋪滿至80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化細胞、經PBS洗液洗滌后收集細胞，按每孔8.0×104CELL等量接種至6孔培養板內，隨機分為8組，每組3孔。將6孔板置于37℃，5% CO2培養箱中繼續培養，此時記作第0天。以后每3 d取3孔細胞消化，每孔計數3次，結果以3孔的細胞均數表示。如此至第8組結束，繪制細胞生長曲線，橫坐標為觀察時間，縱坐標為平均細胞數。

1.2.3 肌內前體脂肪細胞的誘導分化 前體脂肪細胞均為第3代細胞開展誘導分化，細胞接種密度為3×103CELL·cm-2，細胞長滿后先換分化培養液（DMEM+10%FBS+1%雙抗+1 μmol·L-1地塞米松+10 mg·L-1胰島素+0.5 mmol·L-1IBMX）培養2 d，再換培養液（DMEM+10%FBS+1%雙抗+10 mg·L-1胰島素）培養2 d，最后換常規培養基培養8 d，期間，每2 d換1次液。

1.2.4 肌內脂肪細胞的油紅O染色 分別于細胞分化的第4、8和12天棄去培養液，用預冷PBS漂洗細胞3次。用10%甲醛室溫固定30 min，PBS漂洗2次，油紅O染色40 min，棄去染色液后用蒸餾水漂洗剩余染色液，然后在光學倒置顯微鏡下觀察細胞并拍照。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測和統計分析 培養的前體脂肪細胞分別在誘導分化后的第2、4、8和12天收集細胞提取總RNA。細胞總RNA提取根據Takara MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取試劑盒說明書進行。總RNA去除基因組后，取RNA 1 μL用紫外分光光度計測定OD值（OD260、OD280及 OD260/OD280），計算RNA的純度和含量。取1 μg RNA進行逆轉錄，開展qRT-PCR分析。3個基因qRT-PCR的擴增程序均為：95℃10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，40個循環。GAPDH為內參基因，根據2-ΔΔCT法計算基因相對表達量。引物信息詳見表1。

表1 擴增引物序列Table 1 Sequences of amplified primers

1.3 數據分析

應用SPSS 24.0軟件進行單因素方差分析，采用Duncan方法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 綿羊原代肌內前體脂肪細胞的形態

如圖1所示，經胰蛋白酶消化的細胞在貼壁培養至第3天時，貼壁細胞數量明顯增加，細胞呈梭形、不規則倒三角形或星形，呈逐漸伸展狀態；細胞培養至第6天時，細胞呈長梭形且體積進一步增大，伸展狀態更加明顯；細胞培養至第8天時，逐步呈單層匯合狀態，少部分細胞亦可自行分化，但未觀察到脂滴形成。

圖1 綿羊肌內前體脂肪細胞的原代培養（200×）Fig.1 Primary cultured cells of intramuscular preadipocyte in sheep（200 ×）

2.2 綿羊肌內前體脂肪細胞的生長曲線

繪制細胞生長曲線，結果（圖2）表明，生長曲線呈近S型，符合體外細胞增長規律。接種至第6天細胞增長較緩慢，第6至15天進入指數增長期，第15天后逐步進入增長平臺期。

圖2 綿羊肌內前體脂肪細胞的生長曲線Fig.2 Growth curve of intramuscular preadipocyte cells in sheep

2.3 綿羊肌內前體脂肪細胞誘導分化及油紅O染色鑒定

誘導分化劑能夠促使綿羊肌內前體脂肪細胞進入快速分化階段。如圖3所示，誘導分化第4天，觀察到極少數細胞生成小脂滴，生脂細胞數量非常有限；誘導分化第8天，生脂細胞數量隨著細胞分化的加快明顯增加，脂滴數量顯著增多，多個小脂滴逐步匯合后呈串狀；誘導分化第12天，成脂細胞產生大量脂滴，且脂滴體積增大。油紅O將脂滴染成紅色，說明前體脂肪細胞已分化為成熟的脂肪細胞。

圖3 綿羊肌內前體脂肪細胞的誘導分化（100×）Fig.3 Induced differentiation of intramuscular preadipocyte in sheep（100 ×）

2.4 綿羊肌內前體脂肪細胞CNR1和FABP4基因表達規律及差異

肌內前體脂肪細胞CNR1基因的相對表達量隨分化時間延長逐漸增加（圖4），其中，第12天的表達量顯著或極顯著高于第2、4、8天的表達量；第8天的表達量顯著高于第2天的表達量，但與第4天表達量差異不顯著；第4天表達量與第2天表達量差異不顯著。FABP4基因的表達量也隨分化時間呈逐漸升高趨勢（圖4），其中，第12天的表達量極顯著高于第2、4、8天的表達量；第8天的表達量顯著高于第4天的表達量，極顯著高于第2天的表達量；第4天的表達量與第2天表達量差異不顯著。比較CNR1和FABP4基因在相同分化時間時的表達量，結果（圖5）表明，在第2、4、8天時，CNR1和FABP4基因表達量差異不顯著；在第12天，FABP4基因的表達量顯著高于CNR1基因。

圖4 綿羊肌內前體脂肪細胞CNR1和FABP4基因的表達量Fig.4 CNR1 and FABP4 expression level of intramuscular preadipocyte

圖5 CNR1和FABP4基因的表達量Fig.5 Difference of CNR1 and FABP4 Expression

3 討論

脂肪組織在動物能量代謝中發揮重要作用。研究發現，脂肪組織源于動物胚胎中胚層分化的間充質干細胞群，而脂肪干細胞能夠由間充質干細胞群差異分化形成[26]，且脂肪干細胞進一步分化形成動物前體脂肪細胞。體外前體脂肪細胞能夠廣泛開展動物脂肪代謝等研究，是深入揭示動物脂肪沉積分子基礎的首選研究對象。在特定的體外誘導和培養條件下，前體脂肪細胞最終分化為成熟的脂肪細胞，發揮脂滴合成、脂肪因子分泌和脂質儲存等多種功能[27-28]。目前為止，僅從小鼠中分離出成熟的脂肪細胞系，如3T3-L1、3T3-F442A和ob17等；其他絕大多數動物只能開展原代分離培養前體脂肪細胞[23，29-33]，進而誘導分化為成熟脂肪細胞。本研究從湖羊羔羊背最長肌組織中采用差速貼壁法分離原代前體脂肪細胞，其技術難度較高，因為新生羔羊背肌組織中可能混有不同的細胞，如成纖維細胞、成肌細胞等。基于細胞貼壁時間先后（成纖維細胞最早貼壁，而前體脂肪細胞貼壁早于成肌細胞），首先將細胞懸液培養2 h，貼壁較快的細胞最早貼壁，未貼壁細胞懸液轉移接種至新培養皿；新培養皿細胞培養2.5 h后棄培養液除去未貼壁細胞，貼壁細胞繼續培養可獲得純化的前體脂肪細胞。針對不同動物的前體脂肪細胞，不同誘導方法的誘導效率存在差異。研究發現，油酸法誘導SW872前脂細胞效率最佳[34-35]；DEX+IN誘導豬前體脂肪細胞10 d觀察到成熟脂肪細胞[36-37]；IBMX+DEX+IN誘導山羊背肌前體脂肪細胞9 d觀察到成熟脂肪細胞[20]；本研究用IBMX+DEX+IN誘導綿羊背肌前體脂肪細胞效率低于李戡等[25]結果，可能是由于二次換液后胰島素誘導劑的作用時間不同。

動物肌內脂肪沉積表現為肌內脂肪細胞的增殖和肥大。目前，前人對綿羊和山羊肌內脂肪細胞分化過程中多個基因的表達特征及調控進行了研究，如FTO、LPL、PPARγ、LIPIN、AMPK、C/EBPβ、C/EBPα、SREBP1、AP2 和 Wnt10b[20，25，38]。除肌內脂肪細胞增殖分化外，肌內脂肪細胞肥大也對肌內脂肪沉積有顯著影響。研究發現，飼喂以谷物為基礎的精飼料后，動物肌內脂肪細胞的尺寸和大小顯著增加[38-39]，因為精飼料中富含的碳水化合物能夠通過脂肪合成代謝途徑轉變為脂肪儲存于肌內脂肪細胞，有利于肌內脂肪細胞增大[40]。因此，同時從綿羊采食和能量代謝兩個角度研究肌內脂肪沉積對揭示綿羊IMF含量的分子基礎具有重要意義。

本研究發現，CNR1基因的表達量隨著誘導分化呈逐漸升高趨勢，分化后期CNR1基因表達量顯著高于中前期，說明CNR1基因在肌內脂肪細胞增殖分化和體積增大中發揮重要作用。CNR1基因編碼的功能蛋白CB1受體屬于A級G蛋白偶聯大麻素受體（G-protein-coupled cannabinoid receptor，GPCR），該蛋白在下丘腦、脂肪和肌肉組織廣泛分布[8，41]。研究發現，脂肪組織分泌的內源性大麻素激活下丘腦CNR1基因高表達有利于增加小鼠食欲和食量[42]，且其在脂肪組織中激活CNR1高表達有利于刺激脂肪生成[43]，因此，推測綿羊肌內脂肪細胞CNR1高表達有利于肌內脂肪沉積。FABP4基因在細胞內主要結合和轉運長鏈脂肪酸，研究證實，綿羊FABP4基因變異顯著影響肌內脂肪沉積[44-47]。本研究發現，綿羊肌內脂肪細胞FABP4基因同樣隨誘導分化時間的延長呈逐漸升高趨勢，分化后期FABP4基因表達量顯著高于中前期，與前人研究結果相一致[48]。研究表明，脂肪細胞分化過程中FABP4基因轉錄受多種因素調控，如脂肪酸、胰島素及過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ）[49]，推測綿羊生長過程中過多吸收脂肪酸引起FABP4基因高表達，從而促進肌內脂肪沉積。進一步分析發現，脂肪細胞分化后期CNR1表達量顯著低于FABP4基因表達量，說明CNR1和FABP4基因可能在綿羊肌內脂肪沉積中發揮不同作用。動物脂肪組織過量分泌內源性大麻素會負向調控動物食欲[50]，表明綿羊體內內源性大麻素水平可能影響肌內脂肪組織CNR1和FABP4基因表達，進而影響肌內脂肪沉積。報道發現，小鼠CNR1基因調控ACC-1和FASN基因高表達引起小鼠肥胖[12]，因此，進一步研究綿羊CNR1基因與FABP4基因調控關系有助于更深入理解肌內脂肪沉積的調控機制。