烤煙葉片葉綠體超微結構與質體色素降解產物的關系初探

王玉， 李春光， 劉歡， 張月華， 馮曉民， 李耀光，李懷奇， 景延秋*， 孫覓*

（1.河南農業大學煙草學院，鄭州 450002；2.河南中煙工業有限責任公司技術中心，鄭州 450002；3.河南中煙工業有限責任公司黃金葉生產制造中心，鄭州 450002）

葉綠體普遍存在于植物細胞中，是進行光合作用的重要細胞器[1]，與煙葉的生長發育和烤煙內在品質的形成關系密切[2]。質體色素降解產物是決定煙葉揮發性香味物質總量高低的關鍵致香成分[3-4]。煙葉葉綠體中的質體色素包括葉綠素和類胡蘿卜素，主要存在于類囊體膜上，它們的合成和積累與光合作用具有緊密聯系[2]。不同部位的煙葉由于生長條件不同，化學成分含量差異較大，質體色素降解產物含量的差異與其前體物質含量的差異有關，反應了葉綠體超微結構的變化。因此，研究烤煙不同部位葉片葉綠體超微結構差異對質體色素降解產物含量的影響具有重要意義。任春瓊等[5]研究發現，隨著葉位的升高，葉綠體中淀粉顆粒與嗜鋨顆粒的積累量增多，基粒片層斷裂程度加重，葉綠體結構破損更加劇烈。云菲等[6]研究表明，光氮互作效應對葉綠素及類胡蘿卜素降解產物有極顯著影響，適度弱光和增加施氮量有利于質體色素降解產物的合成和積累。劉典三等[7]研究發現，煙葉的類胡蘿卜素降解產物含量隨葉位的升高而增加，降低光照強度后，質體色素降解產物的總含量減少。張國顯等[8]研究表明，隨著葉位的升高，烤煙葉綠素與類胡蘿卜素的降解產物含量均表現為先增加后降低趨勢。目前，關于烤煙葉片葉綠體微觀結構和質體色素降解產物含量的研究多集中在單一方面，而對于烤煙葉片葉綠體結構差異與質體色素降解產物含量關系的研究較少。因此，本研究以云煙87為試驗材料，通過對不同部位未熟和適熟的煙葉葉綠體超微結構進行觀測，進一步探討其與質體色素降解產物含量的關系，旨在從葉片細胞超微結構角度解釋不同部位間質體色素降解產物含量差異的成因，為研究煙葉香味品質的形成提供新的研究途徑與理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗以云煙87為供試品種，于2020年在河南省三門峽市靈寶市的示范煙田（E 110°41′，N 34°21′）進行。試驗地煙草生長季平均氣溫21.69℃，降水量329.43 mm，日照總時數817.6 h。煙苗于2020年5月10日（苗齡70 d左右）采用膜下小苗移栽方式進行移栽。試驗田肥力中等，土壤基本理化性質為：pH 7.19，堿解氮70.56 mg·kg-1、速 效 磷 8.29 mg·kg-1、速 效 鉀 159.47 mg·kg-1、有機質 15.82 g·kg-1。

1.2 試驗設計

試驗采用隨機區組設計，3次重復，共6個小區，周圍設置保護行，各小區均栽植煙株360株，行距120 cm，株距50 cm，按照田間優質煙葉管理方法進行管理，煙田施氮量為65 kg·hm-2。試驗于2020年8—9月分別取下部葉（lower leaves，LL；葉位 5～7）、中部葉（middle leaves，ML；葉位 10～12）和上部葉（upper leaves，UL；葉位16～18）的未熟和適熟2種成熟度煙葉，不同部位不同成熟度的鮮煙葉外觀判定標準[9]詳見表1。對應成熟度和葉位范圍在每個小區選取完整、大小一致、具有代表性的鮮煙葉5片用于透射電子顯微鏡觀測葉綠體超微結構；并取該批次的上、中、下3個部位的初烤煙葉樣品各1 kg進行質體色素降解產物的檢測分析。

表1 不同部位煙葉成熟度標準Table 1 Criteria for maturity level of flue-cured tobacco from different leaf position

1.3 試驗方法

1.3.1 煙葉透射電鏡樣品的制備與觀測 在鮮煙葉的葉中部避開主側脈切取1 mm×2 mm的小片，立即放入4%戊二醛固定液（pH 7.2）中，于4℃保存，之后再用1%鋨酸固定。然后按照常規超薄切片法進行脫水、滲透、包埋、聚合、切片和染色（醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙重染色）[5]，再用JEM-1400透射電子顯微鏡（日本）觀測并拍照，加速電壓100 kV，每個處理觀察10個視野。

1.3.2 烤煙中性香氣成分含量的測定 將20 g初烤煙葉的煙末樣品置于蒸餾萃取裝置提取香味物質，提取液經由二氯甲烷萃取后，于旋轉蒸發儀上濃縮至1 mL進行氣相色譜-質譜鑒定。采用HP6890-5975氣質聯用儀（美國）定性測定，采用乙酸苯乙酯溶液作內標進行定量測定[10]。各樣品均重復3次，取平均值。

依據各中性香氣成分定性和定量測定結果，統計葉綠素降解產物含量（chlorophyll degrading products content，CHLDPC）、類胡蘿卜素降解產物含 量 （carotenoid degrading products content，CARDPC）、中性香氣成分總量（neutral aroma component contents，NACC），其中，中性香氣成分中葉綠素降解產物主要為新植二烯[6]，因此，以新植二烯含量（neophytadiene content，NC）代表葉綠素降解產物含量。

采用以下公式計算葉綠素降解產物新植二烯占比（Pa）和類胡蘿卜素降解產物占比（Pb）。

1.4 數據處理

運用Microsoft Excel 2010進行數據的統計整理，運用Adobe Photoshop CC 2019進行圖片整理，運用SPSS 25.0進行方差分析和相關性分析。根據Goodenough等[11]改進的Teichler-Zallen法對每個樣品的葉綠體基粒片層進行統計。

2 結果與分析

2.1 不同部位未熟和適熟煙葉的葉綠體超微結構特征

從圖1A～C可看出，未熟的上、中、下部葉中葉綠體均具有較完整的雙層膜、基粒和基質片層結構，且基粒中垛疊的類囊體個數較多。上部葉的淀粉顆粒體積最大，多數呈不規則形狀，單個葉綠體中的基粒數與嗜鋨顆粒數最多，垛疊層數較厚，整體結構緊貼細胞壁（圖1A）；中部葉的淀粉顆粒呈橢圓形，積累量和嗜鋨顆粒數較上部葉少，單個葉綠體中的基粒數和類囊體垛疊程度較少（圖1B）；下部葉的淀粉積累量和嗜鋨顆粒數最少，體積最小，淀粉顆粒呈長橢圓形（圖1C）。綜上所述，隨著葉位的上升，未熟煙葉淀粉顆粒和嗜鋨顆粒的積累量逐漸增多，葉綠體整體結構逐漸貼近細胞壁，葉綠體結構的完整程度逐漸下降。

從圖1D～F可看出，適熟的上、中、下部葉中都積累了大量的淀粉顆粒和嗜鋨顆粒，且數量較相同部位的未熟葉片多，而基粒和類囊體個數較未熟葉略少。上部葉的葉綠體外膜破損嚴重，淀粉顆粒向細胞中部游離，多數呈不規則形狀，嗜鋨顆粒含量最多（圖1D）；中部葉的葉綠體結構相對上部葉完整，淀粉顆粒呈不規則形狀（圖1E）；下部葉的葉綠體結構最為完整，淀粉顆粒體積最小，呈長橢圓形（圖1F）。中部葉和下部葉的葉綠體結構緊貼細胞壁排列。綜上所述，隨著葉位的升高，適熟煙葉葉綠體結構的解體程度逐漸增加；基粒片層結構松散、解體加劇，類囊體垛疊程度降低；嗜鋨顆粒和淀粉顆粒數量增多，體積增大。

圖1 不同部位未熟和適熟煙葉的葉綠體結構特征Fig.1 Chloroplast ultrastructure character in unripe and ripe leaves of different leaf positions

2.2 不同部位未熟和適熟煙葉的葉綠體超微結構統計

由表2可知，不同部位未熟和適熟煙葉的葉綠體中淀粉顆粒、嗜鋨顆粒和基粒的含量差異顯著；隨著葉位的升高，葉綠體中淀粉顆粒和嗜鋨顆粒的含量呈現逐漸增多的趨勢。未熟煙葉葉綠體的基粒數表現為：上部葉＞中部葉＞下部葉；但適熟煙葉葉綠體的基粒數隨著葉位的升高而減少。隨著成熟度的提升，各部位煙葉葉綠體的淀粉顆粒、嗜鋨顆粒含量逐漸增多；上、中部煙葉的基粒數隨之減少，下部葉的基粒數隨之增多。

表2 不同部位未熟和適熟煙葉單個葉綠體的超微結構統計Table 2 Statistics of chloroplasts ultrastructure in flue-cured tobacco leaves of different positions at unripe and ripe stages

由圖2可知，在未熟煙葉中，上部葉中存在片層數在30以上的高基粒片層；中部葉和下部葉的高基粒片層還未出現。上部葉中基粒片層數在20～40間的占比(51.06%)顯著高于中部葉和下部葉；中部葉中基粒片層數在16～30間的占比（62.42%）顯著高于下部葉；下部葉中基粒片層數在15以下的占比（72.05%）較大。由此表明，未熟煙葉中高葉位葉綠體中高基粒片層數占比較高，基粒片層的垛疊程度較高。

圖2 不同部位未熟煙葉葉綠體的基粒片層數Fig.2 Grana lamellae number in chloroplasts of unripe leaves at different leaf positions

由圖3可知，適熟煙葉的上部葉中高基粒片層已經消失，而中部葉和下部葉出現了片層數高于30的高基粒片層。下部葉中基粒片層數在20～40間的占比（46.66%）顯著高于中部葉（22.43%）和上部葉（7.43%）；中部葉中基粒片層數在10～20間的占比最高（64.11%）；上部葉中基粒片層數在10以下的低基粒片層占比最大（66.23%）。由此表明，隨著成熟度的增加，煙葉葉綠體基粒片層的垛疊程度下降，基粒片層結構解體程度加劇。

圖3 不同部位適熟煙葉葉綠體的基粒片層數Fig.3 Grana lamellae number in chloroplasts of ripe leaves at different leaf positions

2.3 不同部位適熟煙葉葉綠素降解產物含量的差異

由圖4可知，成熟的煙葉烘烤后，不同部位間新植二烯（葉綠素降解產物）的含量差異顯著。隨著葉位的升高，新植二烯含量呈逐漸增加趨勢，表現為上部葉＞中部葉＞下部葉。其中，上部葉的新植二烯含量占中性香氣成分總量的80%以上，顯著高于中部葉和下部葉；中部葉和下部葉的新植二烯占比差異不顯著，均為70%左右。

圖4 不同部位適熟煙葉的新植二烯含量及占比Fig.4 NC content and proportion in ripe flue-cured tobacco leaves of different leaf positions

2.4 不同部位適熟煙葉的類胡蘿卜素降解產物的含量差異

由圖5可知，類胡蘿卜素降解產物總量隨著烤煙葉位的升高而增加。不同部位間差異顯著，表現為上部葉＞中部葉＞下部葉，與葉綠素降解產物含量變化一致。類胡蘿卜素降解產物占中性香氣成分總量的比例在上部葉和中部葉中為10%左右，顯著低于下部葉。

圖5 不同部位適熟煙葉類胡蘿卜素降解產物含量Fig.5 CARDPC content and proportion in ripe flue-cured tobacco leaves of different leaf position

由表3可知，上、中、下部葉的β-大馬酮含量占類胡蘿卜素降解產物總量的比例最高，為19.33%～23.19%；上部葉的6-甲基-5-庚烯-2-醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮、β-大馬酮、β-二氫大馬酮、二氫獼猴桃內脂含量顯著高于中部葉和下部葉；巨豆三烯酮的4個同分異構體和螺巖蘭草酮的含量以中部葉最高，顯著高于上部葉和下部葉；下部葉氧化異佛爾酮的含量顯著高于上部葉和中部葉。

表3 不同部位適熟煙葉的香味物質含量Table 3 Contents of aroma constituents in ripe flue-cured tobacco leaves of different leaf position （μg·g-1）

2.5 煙葉的質體色素降解產物含量與葉綠體超微結構指標的相關性分析

由表4可知，未熟和適熟煙葉中單個葉綠體的淀粉顆粒、嗜鋨顆粒與葉綠素和類胡蘿卜素降解產物的含量均呈極顯著正相關。單葉綠體中基粒數與未熟煙葉的類胡蘿卜素降解產物和新植二烯含量呈極顯著正相關，而與適熟煙葉中類胡蘿卜素降解產物和新植二烯含量呈極顯著負相關。

表4 煙葉單個葉綠體超微結構指標與質體色素降解產物含量的相關性分析Table 4 Correlation analysis between single chloroplast ultrastructure and plastid pigment degrading products content of flue-cured tobacco

由表5可知，未熟煙葉中，新植二烯和類胡蘿卜素降解產物的含量與基粒片層數在30以上占比呈極顯著正相關，與基粒片層數在21～30間的占比呈顯著正相關，與基粒片層數在5以下的低基粒片層占比呈極顯著負相關；適熟煙葉中，新植二烯和類胡蘿卜素降解產物的含量與基粒片層數在10以下的占比呈極顯著正相關，與基粒片層數在20以上的占比呈極顯著負相關。

表5 煙葉葉綠體基粒片層數與質體色素降解產物含量的相關性分析Table 5 Correlation analysis of chloroplast granum lamella number and plastid pigment degrading products content of flue-cured tobacco

3 討論

3.1 成熟度對煙葉葉綠體超微結構的影響

葉綠體的超微結構特征與植物的生長發育狀況密切相關[12]。研究表明，隨著煙葉成熟期的推進，葉綠體基粒片層結構逐漸解體，淀粉和嗜鋨顆粒積累量增多[13]，成熟期不同部位煙葉葉綠體的膜結構均離散降解[14]。本研究也表明，上、中、下部位適熟煙葉的淀粉顆粒、嗜鋨顆粒數量和低基粒片層數的比例均高于未熟煙葉，隨著成熟度的提升葉綠體結構破裂解體加劇。這主要由于煙葉在成熟過程中，葉片中相關酶活性降低，膜脂過氧化作用增強[15-16]，進而導致葉綠體膜結構衰退[17]。

3.2 葉位對煙葉葉綠體超微結構的影響

葉綠體中基粒片層結構決定了葉綠體對光能的吸收、傳遞和轉化能力[15]。本研究表明，煙葉葉位越高，葉綠體基粒片層結構解體程度越高；隨著葉位的升高，未熟煙葉中高基粒片層數的比例較高，而適熟煙葉中低基粒片層數的比例較高。這可能是由于煙葉未熟時，細胞能量和物質代謝水平更強，葉綠體發育良好[18]，光照通過影響光受體、光敏色素作用因子、生物合成相關基因的表達來促進葉綠素和類胡蘿卜素的生成[19-21]，使得高葉位煙葉葉綠體基粒片層的垛疊程度更高；而在適熟期，細胞逐漸衰老，葉綠體結構不完整[12-13，22]，高葉位煙葉由于接受到較強的光照，使葉片中的酚-過氧化物酶系統加速了葉綠體膜結構衰退[17]，導致其解體程度較低葉位煙葉更高。

本研究表明，未熟和適熟煙葉的淀粉顆粒與嗜鋨顆粒積累量均隨著葉位的升高而增多。這主要由于高葉位煙葉的基粒數與基粒片層垛疊數更多，光能轉化效率更高，光合產物淀粉的積累量更多[5，23]；且嗜鋨顆粒是類囊體膜解體產生的脂質與鋨酸結合產生[20]，因此，高葉位煙葉中積累的淀粉顆粒與嗜鋨顆粒更多。

3.3 葉位對烤煙煙葉質體色素降解產物含量的影響

質體色素降解產物占煙葉中性香味物質總量的85%～96%，在煙葉成熟和調制過程中，葉綠體中的酶催化葉綠素分解產生的葉綠醇大量脫水生成新植二烯[24]，類胡蘿卜素通過光敏氧化降解產生多種香味物質[25]。本研究表明，隨著葉位的升高，葉綠素降解產物新植二烯和類胡蘿卜素降解產物的含量均增多，且不同葉位間差異顯著，與前人研究結果一致[7-8，26-27]。這可能是由于烤煙在大田生長期間，不同部位煙葉所受的光照條件不同，葉片接受的光照強度、日照時數和有效積溫均存在差異，而成熟期的高溫有助于葉綠體結構的降解以及質體色素降解產物的生成[28]，致使煙葉質體色素降解產物的含量在不同部位間表現出顯著差異。

3.4 鮮煙葉葉綠體超微結構與質體色素降解產物的關系

質體色素降解產物與葉綠體超微結構指標的相關分析結果表明，不同成熟度煙葉的單個葉綠體中淀粉顆粒數、嗜鋨顆粒數與葉綠素降解產物新植二烯、類胡蘿卜素降解產物含量均呈極顯著正相關關系。由于淀粉顆粒與嗜鋨顆粒的積累量主要受基粒片層結構的影響，葉綠體中高基粒片層數的占比越高，淀粉顆粒與嗜鋨顆粒的含量越多[23，29]，而質體色素主要存在于基粒片層結構上[2]，因此該相關關系為間接正相關關系。

質體色素降解產物與葉綠體基粒片層結構的相關分析表明，各部位未熟煙葉的葉綠素降解產物新植二烯、類胡蘿卜素降解產物的含量與基粒個數、高基粒片層比例均呈極顯著正相關關系，與低基粒片層比例均呈極顯著負相關；各部位適熟煙葉的葉綠素降解產物新植二烯、類胡蘿卜素降解產物的含量與基粒數、高基粒片層數呈極顯著負相關，與低基粒片層比例均呈極顯著正相關。這主要是由于在未熟的高葉位煙葉葉綠體中，基粒數、高基粒片層數的占比較高，存在于基粒類囊體上的質體色素含量就較高[2]；而高葉位煙葉葉綠體基粒片層的垛疊程度更高，在成熟的過程中，基粒片層結構發生破裂紊亂[13]，能夠離散出更多的低基粒片層；且隨著葉綠體膜結構的衰退使得烤煙的質體色素降解產物含量增多[28]。因此，煙葉葉綠體中基粒數、基粒片層結構的垛疊程度以及基粒片層結構的解體程度共同影響了烤煙質體色素降解產物的含量。