骨碎補總黃酮在大鼠骨折愈合過程中組織病理學研究

王雪峰 薛 徽 楊 松 曹立新 張云龍 艾中偉

(1 齊齊哈爾醫學院附屬第一醫院/骨外科 黑龍江 齊齊哈爾 161000 2 齊齊哈爾醫學院附屬第一醫院/口腔科 黑龍江 齊齊哈爾 161000 3 齊齊哈爾醫學院附屬第一醫院/體檢科 黑龍江 齊齊哈爾 161000 4 齊齊哈爾醫學院病理學院 黑龍江 齊齊哈爾 161000)

骨折是指骨完整結構被破壞，是臨床常見創傷性疾病，導致其發病的因素多樣，骨折治療原則以恢復骨骼正常結構及功能，臨床對于不同的骨折有著不同的治療方案，臨床常見內固定術及石膏固定法。而骨不連，骨延遲愈合是困擾臨床多年的疑難問題[1-2]。隨著中醫學的不斷發展，用于輔助臨床治療的效果顯著，中醫認為，骨生長發育取決于腎精勝衰，腎精不足，則髓不榮、骨生慢，故而生骨以補腎為主[3]。骨碎補是我國傳統中藥之一，具有補腎固元，消腫祛瘀之功效[4]。骨碎補黃酮(TFDF)是其主要有效成分，近年多位學者表示骨碎補黃酮(TFDF)可有效促進骨鈣吸收，從而達到骨愈合的作用[5-6]。但對于其作用機制臨床尚不明確，本研究以脛骨骨折為例，建立SD大鼠模型，以組織學病理研究為基礎進行骨碎補黃酮促進骨愈合機制研究觀察。

1 材料與方法

1.1實驗動物

SPF級大鼠60只，雄性，10周齡，體重210～220 g，購于吉林和元生物工程股份有限公司，許可證號：SYXK(吉)2021-0005；在標準環境中飼養，并自由采食飲水。

1.2實驗藥品、試劑與儀器

TFDF采自北京岐黃制藥有限公司(批準文號：國藥試字Z20020002)；骨鈣素(OCN)、堿性磷酸酶(ALP)及血管內皮細胞生長因子(VEGF)試劑盒均采自上海酶研生物科技有限公司；阿爾辛藍標準品試劑采自深圳海思安生物科技有限公司；顯微CT(Micro-CT)采自GE公司 Locus SP型。

1.3實驗大鼠分組、模型構建及給藥

將60只大鼠進行適應性喂養1周后，隨機分為藥物組、對照組，每組各30只。

大鼠均采用戊巴比妥鈉進行腹腔注射麻醉，待麻醉起效后，將大鼠右下肢皮膚進行備皮處理后行骨折及內固定處理：將大鼠以仰臥位，采用聚維酮碘進行皮膚消毒，在大鼠脛骨前方做一長約2cm縱行切口，將髕韌帶完全暴露，將注射器針頭從內側髕韌帶遠端插入點插入大鼠脛骨髓腔，穿破脛骨，用刀片造成脛骨橫向骨折。骨折形成后，以注射器針頭作為內固定器穿入大鼠脛骨髓腔內，將多余的針頭剪掉并消毒縫合，將同側腓骨進行保留。術畢在大鼠麻醉狀態下進行X線檢查，確保實驗大鼠均為脛骨中斷單橫骨折。最后將實驗大鼠送至保溫箱等待自然復蘇。并給予為期3d的抗炎治療。于術后第1d開始每日給予藥物組大鼠灌腸喂養TFDF 0.3ml/只，對照組大鼠給予等量生理鹽水灌腸，每日對大鼠飲食、活動、毛色、排泄等一般情況進行觀察。本研究所有涉及動物的操作均得到我院倫理委員會批準，并遵循國家實驗室動物護理和使用指南。

1.4指標觀察

分別于術后第7d、14d、21d各組隨機選取10只大鼠進行斷髓處死后取材。取眼球血進行血清學分析，采用酶聯吸附法檢測血清骨鈣素(OCN)、堿性磷酸酶(ALP)及血管內皮細胞生長因子(VEGF)水平，操作步驟均嚴格按試劑盒說明書進行；取脛骨標本行10%中性甲醛固定48h后取出固定針，置于檢測試管內行Micro-CT檢查，對骨痂整體進行觀察并行定量分析，計算骨痂體積及密度；取脛骨骨折部位行石蠟組織切片制備，骨折線與切片方向垂直，切片行阿爾辛藍染色后于光學顯微鏡下觀察軟骨骨痂及成骨組織病理變化。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 組織病理變化結果

術后7d，骨折部位愈合以纖維骨痂生成為主，三組間觀察無明顯差異；術后14d，軟骨骨痂開始生成取代纖維骨痂，藥物組軟骨骨痂密度明顯高于對照組；術后21d，軟骨骨痂周圍開始出現原始骨小梁，骨折端也逐漸有破骨細胞的生成，藥物組骨小梁密度高于對照組。

2.2 血清學分析結果

兩組在術后7d，OCN、ALP及VEGF水平比較無差異(P>0.05)，術后14d及21d，兩組OCN、ALP及VEGF水平均有上升趨勢(P<0.05)，且藥物組均明顯高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 血清學分析結果

2.3 骨痂體積及密度分析結果

兩組在術后7d，骨痂體積、骨痂密度水平比較無差異(P>0.05)，術后14d及21d，兩組骨痂體積、骨痂密度水平均有上升趨勢(P<0.05)，且藥物組均明顯高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 骨痂體積及密度分析結果

3 討論

脛骨是機體承重的重要骨骼，位于皮下，解剖位較為表淺，因而在經受暴力侵害時，常有骨折發現，為臨床常見下肢創傷，以脛骨干骨折常見。臨床治療常以外科手術復位固定為主，功能康復為輔，大多數骨折患者均可恢復良好，但仍有少部分人出現骨不連，骨愈合滯后等情況，西醫治療較為困難，且易有感染發生，對患者預后不利。隨著中醫學的不斷發展，現已成為臨床常見輔助治療，具有低成本、低風險、療效佳的優勢，得到患者及臨床醫師的青睞。本研究對骨碎補對骨愈合的作用進行觀察。骨碎補內含豐富的黃酮，其TFDF為其主要性成分，現代藥理學[7]稱黃酮具有修護機體組織，促進新陳代謝，增進傷口愈合的作用。既往研究顯示[8-9]，黃酮具有誘導骨活性因子分泌，改善成骨功能的作用。本研究病理組織顯示，藥物組恢復情況明顯優于對照組，提示TFDF具有促進骨骼愈合的作用。

為了解TFDF促進骨愈合的作用機制，本研究對兩組大鼠骨相關指標進行檢測，結果顯示藥物組大鼠OCN、ALP及VEGF水平上升趨勢明顯優于對照組。OCN是由成骨細胞及增生的軟骨細胞合成，具有調節骨骼代謝的作用[10]；骨性ALP由成骨細胞分泌，在骨轉化過程中具有重要作用[11]；VEGF可刺激血管生成，在骨折愈合及骨分化過程中具有主要的血管源性調節作用，有效促進骨愈合[12]。黃酮可能通過上調OCN、ALP及VEGF水平促進骨愈合。骨痂形成是骨性連接最重要的標志，本研究顯示，藥物組骨痂體積及密度增長速度明顯快于對照組，提示TFDF的使用可加快骨性連接的速度，進而促進骨愈合。TFDF具有促進鈣磷吸收的作用，增加鈣磷沉積，促進骨性因子的分泌，提高成骨細胞的增殖活性，從而加快骨痂組織的生成，促進骨愈合[13]。且藥理學指出黃酮還具有抗炎、改善局部微循環的作用，可為骨愈合提供良好環境。本研究顯示術后7d兩組恢復情況無明顯差異，可能與TFDF藥效反應時間有關。且于病理學組織分析可見14d后開始有軟骨骨痂生成，藥物組生成情況優于對照組，21d后差距增大，提示臨床使用可延長其服藥周期，以保證臨床療效。關于毒副反應，本研究30只大鼠在用藥期間均無明顯不良反應發生，提示其安全性較好。

綜上所述，TFDF可能通過上調OCN、ALP及VEGF水平，促進軟骨骨痂生成且加快其向骨性骨痂轉變的進程，提高骨痂密度促進骨愈合；術后14d出現軟骨生成，21d開始進行骨折重建修復。