宮頸癌脫落細胞RBL1啟動子甲基化與患者放療抵抗的關系

霍葉琳，王月，房國濤

(1.保定市第一醫院 婦產科，河北 保定 071000； 2.河北大學附屬醫院 腫瘤科，河北 保定 071000)

宮頸癌為常見婦科惡性腫瘤之一[1]，雖然人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)疫苗接種和早期篩查已經成為預防該疾病的有效策略[2]，但在低/中等收入國家其發病率仍然較高。目前，基于DNA甲基化的檢測方法可以作為檢測宮頸高級上皮內瘤變的重要工具，許多甲基化基因亦被證實為管理HPV陽性女性有希望的標志物。放化療是宮頸癌的基本治療手段之一，但腫瘤細胞輻射抵抗仍然是一個主要的治療障礙[3- 4]，因此有必要尋找新的分子靶點以評估治療結局。視網膜母細胞瘤樣基因1(retinoblastoma- like 1，RBL1)是一種腫瘤抑制基因，能夠對放射線等的DNA損傷作出反應[5]。Pan等[6]研究表明RBL1/p107啟動子甲基化可增強體外三維培養癌細胞的放射抵抗性，但RBL1在宮頸癌中的作用仍缺乏臨床證據支持。本研究旨在探究RBL1甲基化狀態在宮頸癌放療早期反應監測中的應用價值，為深入探究宮頸癌放療抵抗機制和尋找有效的生物標志物提供臨床依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究經保定市第一醫院倫理委員會批準，所有治療程序均按照相關指南執行。從2015年5月至2017年4月期間在該院接受治療的宮頸癌患者中招募了82例患者，接受同步放化療(concurrent chemo- radiotherapy，CCRT)為一線治療。納入標準：(1) 經病理活檢診斷為宮頸癌；(2) 無宮頸癌手術及放化療史。排除沒有完成治療方案者、復發患者、非初治患者或失訪者。通知患者及其家屬采集樣本，并簽署知情同意書。在CCRT之前(T0)進行組織基因甲基化檢測，另外在T0及放療期間(T1：放療中期；T2：放療結束)進行磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)檢查。通過將基線MRI結果與放療后3個月的MRI結果進行比較，確定腫瘤早期治療反應。

1.2 治療

所有患者均接受體外放射治療(external beam radiotherapy，EBRT)聯合腔內近距離治療(intracavitary brachytherapy，ICR)。治療全程總劑量為45～50 Gy。每周1次聯合35～40 mg·m-2順鉑治療。根據患者的情況調整治療方案。

1.3 MRI監測及腫瘤治療反應評估

在T0進行基線腫瘤評估，治療后3個月通過MRI、視覺診斷和體格檢查確定最終治療反應，并與基線進行比較。以完全緩解(complete remission，CR)、部分緩解(partial remission，PR)、疾病穩定(stable disease，SD)或進展(progressive disease，PD)評價臨床療效。將獲得CR或PR的患者納入放療敏感組，SD或PD的患者納入抵抗組。根據T2加權像測量腫瘤的長度(length，L)、寬度(width，W)、高度(height，H)，計算腫瘤體積為1/6π×W×H×L。腫瘤體積的變化(%)=(治療前體積-治療后體積)/治療前體積×100%。

1.4 定量甲基化PCR(quantitative methylation- specific PCR，qMSP)檢測RBL1基因啟動子甲基化狀態

宮頸脫落細胞在婦科檢查時用子宮頸刷獲得，離心后存放在-20 ℃磷酸鹽緩沖生理鹽水中，用標準酚- 氯仿法提取基因組DNA，并進一步純化。利用EpiTect甲基化轉化試劑盒(德國Qiagen公司)將200～500 ng DNA樣本進行亞硫酸鹽轉化，純化后用于后續測序。在LC480熱循環系統(德國Roche Applied Science公司)上進行甲基化特異性PCR，以確定RBL1基因甲基化水平。RBL1甲基化特異性引物(M)：正向5′- GGAGGTATTTTATTATGTTGTATGA- 3′，反向5′- TCCTTAACCCTTAACTAATCACAAA- 3′；RBL1非甲基化特異性引物(U)：正向5′- GGAGGTATTTTATTATGTTGTATGA- 3′，反向5′- TCCTTAACCCTTAACTAATCACAAA- 3′。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、52 ℃(U)或56 ℃(M)30 s，40個循環；72 ℃ 30 s。以Ⅱ型膠原基因(Type Ⅱ collagen gene，COL2A)作為內參。將上述反應的PCR產物在2%瓊脂糖凝膠電泳分離基因條帶，甲基化條帶陽性和非甲基化條帶陰性/陽性皆納入甲基化組；否則為非甲基化組。此外利用以下公式評價甲基化水平，即交叉點值(crossing point，Cp)變化(ΔCp)：ΔCp=Cp靶基因-CpCOL2A。ΔCp值越小表示甲基化程度較高。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 治療前RBL1基線甲基化狀態與患者臨床病理特征的關系

經qMSP法和瓊脂糖凝膠電泳分析，治療前68例患者宮頸脫落細胞中RBL1基因出現甲基化表達，納入甲基化組，另14例則納入非甲基化組。分析RBL1基線甲基化狀態與臨床結果的相關性發現，CCRT治療前RBL1基線甲基化狀態與早期治療反應有關(P<0.05)，而與患者年齡及腫瘤國際婦產科聯盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO)分期、病理類型、HPV感染狀態、淋巴結轉移無關(P>0.05)，見表1。

表1 患者治療前RBL1基線甲基化狀態與臨床病理特征的關系

2.2 患者放療期間RBL1基因啟動子甲基化水平變化

重復測量的方差分析結果顯示：(1) 不同時間點RBL1基因啟動子甲基化ΔCp值差異有統計學意義，敏感組與抵抗組患者放療后RBL1基因啟動子甲基化ΔCp值均逐漸降低(F時間=44.015，P<0.001)；(2) 敏感組與抵抗組患者RBL1基因啟動子甲基化ΔCp值比較差異有統計學意義(F組別=38.757，P<0.001)，各時間點抵抗組患者的RBL1基因啟動子甲基化ΔCp值均低于敏感組(P<0.001)；(3) 敏感組與抵抗組患者RBL1基因啟動子甲基化ΔCp值變化趨勢差異有統計學意義(F組別×時間=16.832，P<0.001)，抵抗組患者放療后RBL1基因啟動子甲基化ΔCp值降低程度大于敏感組。此外抵抗組患者T1、T2時的ΔCp值較基線值變化率均大于敏感組(P<0.001)。見表2。

表2 放療敏感組與抵抗組患者放療期間RBL1基因啟動子甲基化水平變化

2.3 單因素和多因素Logistic回歸分析影響宮頸癌放療早期反應的臨床因素

以患者放療抵抗=1、放療敏感=0作為因變量，經單因素和多因素Logistic回歸分析，腫瘤體積≥15.35 cm3和RBL1基線啟動子甲基化都是影響宮頸癌患者發生放療抵抗的獨立危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 單因素和多因素Logistic回歸分析宮頸癌患者發生放療抵抗的臨床因素

2.4 RBL1基線甲基化ΔCp值對宮頸癌患者產生放療抵抗的預測價值

經ROC曲線分析，RBL1基線啟動子甲基化ΔCp值預測宮頸癌患者產生放療抵抗的AUC為0.794(95%CI為0.697～0.892)，最佳臨界值為13.585，在該閾值下，靈敏度和特異度分別為96.2%和53.6%，約登指數為0.498。

3 討 論

宮頸癌早期常無特異性癥狀，這導致大部分患者確診時已處于中晚期，同步放化療是治療中晚期宮頸癌的首選方案[7]，然而放療抵抗被認為是導致治療失敗或預后不良的主要原因，因此早期準確評估宮頸癌患者放療敏感性對預后有重要意義。基因甲基化檢測在宮頸癌篩查和分層中的作用已得到證實[8]。本研究應用qMSP技術對不同時間點宮頸癌細胞RBL1基因進行檢測，發現RBL1基因啟動子甲基化水平可以預測和監測早期治療反應。

腫瘤的發生、發展通常與遺傳、表觀遺傳、環境因素紊亂有關，DNA甲基化屬于表觀遺傳機制的基因表達調控方式，其可引起基因表達的改變及細胞的惡性轉化，如致癌基因激活、抑癌基因轉錄沉默。視網膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)蛋白家族成員相關基因在多種人類惡性腫瘤(如乳腺癌、肺癌、膠質母細胞瘤)中都有不同程度的表觀遺傳學改變[9]，如pRB/p105、RBL2/p130以及RBL1，因其保守口袋結構域被稱為“口袋蛋白”，它們可通過該結構域與病毒癌基因蛋白結合[10- 11]，進而促進細胞增殖及基因組的不穩定性，在宮頸細胞癌變進程中發揮作用。Ullah等[12]研究證實，RBL2基因啟動子高甲基化的乳腺癌組織中RBL2 mRNA表達降低；潘冉冉等[13]基于美國公共癌癥基因數據庫分析發現，RBL1啟動子甲基化與結腸癌發生風險及預后不良有關。在本研究中，我們在脫落的宮頸細胞中檢測到RBL1甲基化率為82.93%，然而RBL1基因啟動子甲基化組與非甲基化組在患者年齡及腫瘤體積、FIGO分期、組織學類型、HPV感染狀態、淋巴結轉移方面沒有顯著差異，提示RBL1甲基化狀態可能不受其他臨床因素的影響。

既往有研究[14- 15]已經發現基因甲基化狀態可用于評估宮頸癌放療敏感性。Pan等[6]通過體外三維培養MCF- 7和A549細胞證實，RBL1啟動子甲基化導致RBL1基因低表達從而增強癌細胞放射抵抗性。這也從細胞學方面解釋了本研究結果。我們的臨床數據顯示，RBL1基因高甲基化與腫瘤早期治療反應不良有關，說明RBL1高甲基化可能是導致宮頸癌細胞對放射線不敏感的主要原因之一。此外，DNA甲基化狀態會受到放射線的影響，可能是輻射誘發癌變的驅動機制之一[14,16]。在本研究中，RBL1基因ΔCp值隨著放療的進行逐漸降低，在放療后期基本穩定，表明腫瘤細胞的表觀遺傳變化可能發生在治療的早期階段，從ΔCp值變化率分析，放療抵抗組RBL1基因甲基化水平升高更明顯，這也進一步證實RBL1基因甲基化是影響放療敏感性的重要機制之一。

綜上，我們發現，RBL1基因甲基化狀態與宮頸癌放療抵抗有關，因此RBL1甲基化作為一個有前途的生物標志物在宮頸癌的治療隨訪中起著重要作用，監測RBL1甲基化的動態變化可以幫助優化個體化治療策略。此外將RBL1甲基化檢測與傳統影像學方法相結合，可能為預測放療抵抗提供一種新的方法。