人β- 防御素- 3調控呼吸道合胞病毒致哮喘幼鼠的氣道重塑及白細胞激活

蔡昌君，黃惠敏，桂冬梅，尹楊艷

(海南醫學院第一附屬醫院 兒科，海南 海口 570100)

哮喘是一種常見的氣道慢性炎癥性疾病，近年來該疾病在全球范圍內發病率急劇增加，且在兒童期發病率最高。呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)、鼻病毒(rhinovirus，RV)和流感病毒(influenza，FLU)是小兒哮喘發作的重要誘因。85%的哮喘急性發作與RSV感染有關，RSV感染是哮喘反復發作和加重的獨立危險因素，能夠誘導哮喘惡化如促進炎癥反應、氣道高反應性和氣道重塑[1- 2]。目前，糖皮質激素和白三烯調節劑作為防治RSV誘發哮喘的主要藥物，對控制哮喘癥狀、減少哮喘急性發作次數有一定作用[3]。然而這些藥物并不能完全治愈哮喘，還存在各種副作用，因此迫切需要尋找安全有效的哮喘臨床治療方法。

人β- 防御素- 3(human β- defensin- 3，hBD3)是一種由45個氨基酸組成的小分子陽離子抗菌肽，具有抗菌譜廣、活性高、安全性好等特點，還能聯系固有的免疫應答，因此被研究者們認為是最有前途的抗菌肽之一[4]。此外，hBD3表現出多種宿主防御功能，參與心血管疾病、胃腸道感染及關節炎等病理過程[5- 7]，但是其在哮喘中的潛在作用及相關機制尚不明確。本研究采用卵清白蛋白(OVA)合并RSV感染建立幼鼠哮喘模型，觀察hBD3對哮喘幼鼠疾病過程的影響，以期闡明其在支氣管氣道重塑和白細胞激活方面發揮的作用及其可能機制，為哮喘診療研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康、SPF級BALB/c幼鼠，4周齡，體重(14±2)g，雌雄各半，購于北京科興中維生物技術有限公司，動物生產許可證號為SCXK(京)2019- 0009。飼養環境設置為溫度22～24 ℃、相對濕度(50±5)%、12 h/12 h明暗周期，期間正常飲食。適應性飼養1周后開始實驗。本研究經我院倫理委員會審批通過。

1.2 主要試劑

hBD3購自美國PeproTech公司，地塞米松(DXM)購自上海澤葉生物科技公司，OVA購自美國Sigma公司，RSV的Long株來源于中國武漢病毒研究所。瑞氏染色、HE染色和PAS染色試劑盒購自北京雷根生物有限公司，Masson染色和免疫組化染色試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司，特異性ELISA試劑盒購自南京凱基生物公司，RIPA裂解液、BCA蛋白測定試劑盒及ECL化學發光液購自上海碧云天生物研究所，兔抗人α- 平滑肌肌動蛋白(α- SMA)、血管內皮生長因子(VEGF)、轉化生長因子- β1(TGF- β1)、胰島素樣生長因子- 1(IGF- 1)單克隆抗體、兔抗GAPDH多克隆抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG購自英國Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 動物模型制備及給藥 將40只幼鼠按照數字隨機表法分為對照組、模型組、hBD3組及DXM組(陽性對照)4組，每組10只。參考文獻[8]制備RSV感染致哮喘模型，除對照組外，其余3組幼鼠在第1天采用多點致敏法分別于兩后足跖、腹股溝、背部、頸部及腹腔皮下注射含2%OVA與2%氫氧化鋁的致敏劑。第14天起，各組腹腔注射0.2 ml致敏劑以加強致敏。第21天后，將幼鼠置于密閉容器內，霧化吸入1% OVA 30 min激發，每日1次，連續10 d，與此同時，hBD3組以100 μg·kg-1·d-1hBD3溶液灌胃，DXM組以0.5 mg·kg-1·d-1DXM溶液灌胃，對照組和模型組灌胃等體積生理鹽水，連續14 d。于第21、35天分別用含1×106PFU的RSV懸液50 μl滴鼻，對照組在造模過程中腹腔注射或霧化吸入等量生理鹽水，并以生理鹽水滴鼻。

1.3.2 肺泡灌洗液(BALF)制備及細胞計數 實驗處理結束后麻醉幼鼠，仰臥位固定，消毒后在頸部正中切口，打開胸腔分離皮下組織和肌肉，暴露氣管。在右側甲狀軟骨與第一、二軟骨環之間進行縫線結扎，在第四、五軟骨環之間做 “T”形切口，插入輸液針頭至氣管腔內，縫線固定，將適量生理鹽水注入肺部，輕柔按摩胸前區，停留30 s后將灌洗液導出，再緩慢注入，重復灌洗3次，收集灌洗液。4 ℃下以2 000 r·min-1離心15 min，棄上清留沉淀，生理鹽水稀釋，滴入細胞計數板，通過顯微鏡(400倍)計數白細胞總數，涂于載玻片，干燥后進行瑞氏染色，隨機選擇5個不同視野，分類計數嗜酸粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞數目。

1.3.3 ELISA試驗 收集各組幼鼠腹部靜脈血和BALF，離心后提取上清液，采用特異性ELISA試劑盒檢測BALF及血清中免疫球蛋白lgE、白細胞介素(IL)- 4、IL- 5、腫瘤壞死因子- α(TNF- α)水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3.4 HE染色 處死幼鼠取其肺組織，清洗后在4%多聚甲醛中固定，常規石蠟包埋，冰凍切片機上制成4 μm切片，進行HE染色，切片復溫，脫蠟脫水，蘇木精染色5 min，流水沖洗，伊紅染色3 min，流水再次沖洗，程序化脫水、透明，中性樹膠封片；光鏡觀察肺組織并拍照。

1.3.5 氣道形態變化分析 取制備的肺組織切片，顯微鏡下獲取肺內支氣管橫斷面，采用Image- Pro Plus軟件分析染色標本，分別測量氣管內周長(Pi)、管壁面積(WAt)、支氣管平滑肌面積(WAm)以及支氣管平滑肌細胞核數目(N)。測量值通過Pi進行標準化，分別記為WAt/Pi、WAm/Pi和N/Pi。

1.3.6 PAS染色 取制備的肺組織切片，脫蠟脫水，置于阿利新藍溶液浸泡10 min，流水沖洗，加過碘酸溶液氧化處理5 min，再浸入Leagene Schiff Reagent液中染色10 min，流水沖洗，蘇木素染核，酸性乙醇分化，加入氨水返藍，流水沖洗后程序化脫水、透明，中性樹膠封片；光鏡觀察肺組織染色情況并拍照；隨機選擇5個不同視野，計數杯狀細胞數目。

1.3.7 Masson染色 取制備的肺組織切片，脫蠟脫水，使用weigert鐵蘇木素溶液染色10 min，1%鹽酸乙醇分化，流水沖洗，Masson染液返藍，蒸餾水洗滌后加麗春紅酸性品紅液染色5 min，1%磷鉬酸水分化，苯胺藍溶液染色5 min，1%冰醋酸水溶液浸泡并洗滌，程序化脫水、透明，中性樹膠封片；光鏡觀察腎組織膠原沉積并拍照；Image- Pro Plus軟件分析染色面積比例。

1.3.8 免疫組化染色 肺組織切片經脫蠟脫水后，0.3%過氧化氫處理30 min，高溫(98 ℃)加熱5 min進行抗原修復，加山羊血清室溫封閉1 h，將切片與兔抗人α- SMA單克隆抗體(1∶200)在4 ℃共同孵育過夜；次日PBS清洗，加入對應的山羊抗兔IgG抗體(1∶5 000)，室溫下孵育1 h，滴加DAB顯色，自來水清洗，蘇木素復染，程序化脫水、透明，中性樹膠封片；光鏡觀察肺組織染色情況并拍攝圖像，胞質染成黃色至棕色即為陽性；隨機選擇5個不同視野，Image- Pro Plus軟件統計陽性染色面積。

1.3.9 蛋白質印跡實驗 取肺組織在無菌環境下剪碎，研磨勻漿，添加RIPA裂解液，提取組織總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度。制備10%SDS- PAGE凝膠，各組分別取30 μg總蛋白上樣，通過電泳分離(電壓50 V，60 min)，再將蛋白電轉至PVDF膜(溫度75 ℃，電壓50 V，60 min)，室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜，加入一抗抗體，4 ℃孵育過夜；次日加入對應HRP標記的二抗抗體，室溫孵育1 h；TBST洗膜，加入ECL化學發光液避光反應30 min；凝膠圖像采集系統進行蛋白顯影，Image- Pro Plus統計軟件對條帶進行分析；以內參GAPDH為基準，計算各蛋白的相對表達水平。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 hBD3對哮喘幼鼠BALF白細胞分類計數的影響

與對照組比較，模型組BALF中細胞總數顯著增加，嗜酸粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞的比例也均高于對照組(P<0.05)；與模型組比較，hBD3組和DXM組的BALF中細胞總數及嗜酸粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞的比例均顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組幼鼠BALF白細胞分類計數比較

2.2 hBD3對哮喘幼鼠BALF和血清中細胞炎癥因子水平的影響

ELISA檢測結果如表2、3所示。與對照組比較，模型組BALF和血清中IgE、IL- 4、IL- 5及TNF- α水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，hBD3組及DXM組BALF和血清中IgE、IL- 4、IL- 5、TNF- α水平均顯著降低(P<0.05)。

表2 各組幼鼠BALF中細胞炎癥因子水平

表3 各組幼鼠血清中細胞炎癥因子水平

2.3 hBD3對哮喘幼鼠肺組織病理學的影響

HE染色結果顯示，對照組肺組織未見明顯的病理損傷，間質間基本無炎癥細胞浸潤；模型組肺組織發生損傷，基底膜增厚，可見大量炎癥細胞浸潤；hBD3組和DXM組肺組織損傷較模型組明顯減輕，炎癥細胞浸潤減少。見圖1。

PAS染色后可見對照組肺組織結構完整，模型組肺組織內有大量杯狀細胞增生，較對照組顯著增加(P<0.05)；hBD3組和DXM組肺組織內杯狀細胞均較模型組顯著減少(P<0.05)。見圖1。

a 與對照組比較，P<0.05； b 與模型組比較，P<0.05

2.4 hBD3對哮喘幼鼠肺組織纖維化的影響

Masson三色染色結果如圖2所示。對照組肺組織中藍染面積小，膠原纖維較少；模型組肺組織中藍染面積分布較對照組顯著增加，膠原纖維增多，組織纖維化現象十分明顯(P<0.05)；與模型組比較，hBD3組和DXM組肺組織中藍染面積顯著縮小，膠原纖維減少，組織纖維化程度減輕(P<0.05)。

a 與對照組比較，P<0.05； b 與模型組比較，P<0.05

2.5 hBD3對哮喘幼鼠氣道重塑程度的影響

各組肺內支氣管各參數檢測結果顯示，模型組肺組織WAt/Pi、WAm/Pi、N/Pi均顯著高于對照組(P<0.05)；而hBD3組和DXM組肺組織WAt/Pi、WAm/Pi、N/Pi均顯著低于模型組(P<0.05)。見圖3。

a 與對照組比較，P<0.05；b 與模型組比較，P<0.05

2.6 hBD3對哮喘幼鼠肺組織α- SMA表達的影響

免疫組化染色結果如圖4所示。與對照組比較，模型組肺組織染色加深，染色面積增加，α- SMA陽性表達率顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，hBD3組和DXM組肺組織染色變淺且面積縮小，α- SMA陽性表達率顯著下降(P<0.05)。

a 與對照組比較，P<0.05； b 與模型組比較，P<0.05

2.7 hBD3對哮喘幼鼠肺組織生長因子及自噬相關蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組肺組織中VEGF、TGF- β1、IGF- 1蛋白表達水平均顯著上升(P<0.05)；與模型組比較，hBD3組和地塞米松組肺組織中VEGF、TGF- β1、IGF- 1蛋白表達水平均顯著下降(P<0.05)。見圖5。

a 與對照組比較，P<0.05； b 與模型組比較，P<0.05

與對照組比較，模型組肺組織內LC3- Ⅱ、Beclin- 1蛋白表達水平均顯著上升(P<0.05)，P62蛋白表達水平顯著下降(P<0.05)；而hBD3組和地塞米松組肺組織內LC3- Ⅱ、Beclin- 1蛋白表達水平均較模型組顯著下降(P<0.05)，P62蛋白表達水平則顯著上升(P<0.05)。見圖6。

a 與對照組比較，P<0.05； b 與模型組比較，P<0.05

3 討 論

防御素是天然免疫系統的重要組成分子，具有廣泛的抗菌、抗病毒和免疫調節特性。人類防御素分為α- 防御素和β- 防御素兩大類。人β- 防御素主要由黏膜和上皮細胞產生，hBD3作為β- 防御素家族的成員之一，也能在內皮細胞中表達，對宿主細胞毒性低。近年來，越來越多的研究表明了hBD3參與多種生理病理過程:hBD3可以誘導腸上皮細胞遷移，并降低壞死性小腸結腸炎新生大鼠模型的嚴重程度和死亡率[9]；hBD3能夠減輕TNF- α刺激的人臍靜脈內皮細胞的炎癥反應和氧化損傷，抑制單核細胞黏附和細胞黏附分子的表達，其作用可能與抑制NF- κB和MAPK信號傳導途徑相關[10]；hBD3還能夠抑制RAW264.7細胞向M1表型極化，在體內和體外均表現出抗牙周炎特性[11]。因此本研究探究hBD3對RSV感染誘發哮喘幼鼠的影響，實驗結果提示，hBD3能夠有效緩解哮喘幼鼠的炎癥反應和氣道重塑，提示其對哮喘幼鼠具有良好的治療效果。

在哮喘的發病機制中，外界刺激作用下的支氣管痙攣起著關鍵作用，同時炎癥也是導致哮喘發作的原因，另一個顯著因素是氣道重塑。慢性呼吸道上皮炎癥會導致微血管發生變化、支氣管壁增厚和支氣管氣流受限，引發通氣受損。在哮喘病理過程中，氣道重塑與許多結構變化有關，例如上皮損傷、皮下纖維化、血管生成、肌成纖維細胞和肌細胞肥大以及氣道平滑肌細胞中平滑肌纖維的數量增加[12- 13]。因此尋找有效的控制氣道重塑的藥物并闡明其分子機制對治療哮喘具有重要意義。VEGF是一種多功能血管生成調節因子，在哮喘患者中過度表達，其表達水平與疾病活動度呈正相關，并與支氣管直徑及氣道高反應性(AHR)呈負相關。相關實驗證據表明，VEGF能夠在小鼠氣道和肺組織中誘導血管生成，促進肺組織結構重塑和炎癥反應[14]。作為調節氣道重塑的主要因子之一，TGF- β1可以促進成纖維細胞前體分化為肌成纖維細胞，并促進肌成纖維細胞的增殖，TGF- β1還有助于氣道平滑肌細胞遷移到上皮層進而促進組織重塑[15]。IGF- 1可以提高膠原蛋白和彈性蛋白含量，增加平滑肌厚度，并在肺組織損傷修復和氣道重塑中發揮重要作用[16]。因此VEGF、TGF- β1及IGF- 1是氣道重塑的經典標志物。本研究結果顯示，經過hBD3作用的哮喘幼鼠，肺組織基底膜增厚、炎癥細胞浸潤以及纖維化現象均明顯減輕，杯狀細胞數目減少，同時肺組織中VEGF、TGF- β1、IGF- 1蛋白表達水平均下降，由此推測，hBD3能夠有效抑制哮喘幼鼠的氣道重塑過程。

白細胞的調節募集是先天免疫反應不可或缺的要素，白細胞激活后能夠釋放大量的促炎癥細胞因子、蛋白水解酶、自由離子基和活性氧等，造成內皮細胞破壞，加重組織損傷[17]。本研究結果顯示，哮喘幼鼠的BALF中細胞總數增加，其中嗜酸粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞的比例也均明顯升高，經hBD3作用的哮喘幼鼠BALF中細胞總數以及嗜酸粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞的比例均明顯降低，此外BALF和血清中IgE、IL- 4、IL- 5和TNF- α水平也均顯著降低。由此反映出hBD3能夠抑制哮喘中白細胞激活，并有效降低促炎細胞因子表達進而調控病理生理過程。

自噬是細胞利用溶酶體途徑降解受損細胞器和大分子的過程，能夠維持體內正常的細胞穩態，并參與多種疾病的病理生理過程。近期研究強調了自噬在哮喘發展中的重要作用。Ban等[18]證實，重度哮喘患者痰和外周血嗜酸粒細胞的自噬水平高于非重度哮喘患者和健康對照者中的自噬水平；Kim等[19]研究發現，布地奈德可以通過介導自噬對人鼻病毒發揮抗病毒作用，從而有效預防哮喘發作，而利用氯喹抑制自噬顯著降低了布地奈德對人鼻病毒的抗病毒和抗炎作用。本研究檢測結果顯示，RSV感染誘發哮喘幼鼠的肺組織內自噬相關蛋白LC3- Ⅱ和Beclin- 1的蛋白表達水平均升高， P62蛋白表達水平下降，而經過hBD3作用的哮喘幼鼠肺組織中LC3- Ⅱ和Beclin- 1的蛋白表達水平均明顯受到抑制，也促進了P62蛋白表達，由此推測hBD3可能通過調控自噬發揮對哮喘幼鼠的保護作用。

綜上所述，本研究推測hBD3能夠改善RSV感染誘發哮喘幼鼠的炎癥和氣道重塑，降低白細胞激活程度，其機制可能是通過調控自噬實現的，這預示了hBD3對支氣管哮喘的臨床治療價值，然而關于自噬如何影響哮喘發展的機制仍有待進一步研究闡明。