miR-223/Fosl2/NGP調控非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝纖維化作用

王航宇 楊文義 韓大正 魏書堂 武利萍 徐夢陽 閆春曉 譚莉霞 董 勇 楊國威 華 靜 杜瑩瑩

非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)可逐步發展成肝硬化，甚至肝癌[1-2]。NASH發病機制復雜，與肝細胞內脂質堆積、氧化應激、線粒體損傷等多重因素有關[3]。隨著深入研究，發現微小RNA(microRNA，miRNA)參與NASH中胰島素抵抗、脂代謝紊亂和細胞凋亡等生物病理進程[4]，同時外周血miR-223可有效反映慢性乙肝纖維化患者乙型肝炎病毒的感染情況和肝纖維化嚴重程度。FOS樣抗原2(FOS-like antigen 2，Fosl2) 是FOS基因家族成員之一，參與腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡等惡性行為。研究[5]顯示，下調Fosl2表達可抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。中性粒細胞顆粒蛋白(neutrophilic granule protein，NGP)是一類半胱氨酸蛋白酶抑制劑，廣泛存在于各種生命體中，可以調節機體炎癥反應。本研究通過分析miR-223/Fosl2/NGP在NASH小鼠中表達水平，初步探討其影響NASH小鼠肝纖維化的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SPF級小鼠60只，4～8周齡，體質量20～22 g，均購于廣東至遠生物醫藥科技有限公司，許可證號：SCXK(粵)2021-0057；在本院動物實驗室中心于20℃～25℃溫度分籠飼養，標準飼料，自由采食進水，光照/黑暗周期為12 h/12 h。

1.2 儀器與試劑 熒光倒置顯微鏡購自廣州市明美光電技術有限公司，Cytation 1細胞成像酶標儀購于北京安麥格貿易有限公司。電泳儀購于武漢科昊佳生物科技有限公司；全自動凝膠成像分析系統ZF-288購于上海金鵬分析儀器有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)儀(IQTM5型)購于美國Bio-Rad公司；紫外分光光度計UV1810購于東莞市譜標實驗器材科技有限公司；RPMI 1640培養基購于艾美捷科技有限公司；胎牛血清購于愛必信(上海)生物科技有限公司；RNA提取試劑TRIzol及轉染試劑Lipofectamine 2 000均購于武漢極捷生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液、油紅O染色試劑盒及二辛可寧酸(bicinchoninic acid assay，BCA)法蛋白濃度測定試劑盒購于金克隆(北京)生物技術有限公司；ECL發光液購于北京伊塔生物科技有限公司；總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、谷丙轉氨酶(alanine transaminase，ALT)和谷草轉氨酶(aspartate transaminase，AST)酶聯免疫吸附檢測(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購于四川邁克生物科技股份有限公司；肝纖維化四項指標試劑盒購于上海心語生物科技有限公司； Fosl2、NGP抗體購于Invitrogen公司。

1.3 小鼠模型建立及分組[6]60只小鼠適應性喂養1周后，隨機分成正常組、模型組(MCD組)、MCD+miR-NC組和MCD+miR-223 mimic組，每組15只。正常組給予普通飼料，其余3組給予蛋氨酸膽堿缺乏(methionine choline deficiency，MCD)飼料(南通特洛菲飼料科技有限公司)。連續飼養4周后，取模型組小鼠2只，觀察其肝組織病理，顯示出典型的脂肪性肝炎特征，則造模成功。小鼠建模成功后，MCD+miR-NC組經尾靜脈注射120 nmol/kg miR-NC 100 μL，MCD+miR-223 mimic組經尾靜脈注射120 nmol/kg miR-223 mimic 100 μL，連續5 d；正常組和MCD組小鼠通過尾靜脈注射相應體積的無菌生理鹽水，連續5 d。繼續飼養3周。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準(倫理批準號：JZLLSC2020-0150)。

1.4 血清及肝臟組織生化指標 取小鼠外眼周血300～500 μL，離心取上清液，采用ELISA試劑盒檢測血清TC、TG、ALT和AST水平。

1.5 肝纖維化指標 取小鼠血液300～500 μL，離心分離上清液。采用放射免疫分析法檢測肝纖維化指標[透明質酸(hyaluronic acids，HA)、層粘連蛋白(laminin，LN)、Ⅳ型膠原(collagentype Ⅳ，Ⅳ-C)]，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6 實時熒光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測miR-223和Fosl2 mRNA水平 采用Trizol法提取細胞中的總RNA，采用紫外分光光度計法測定RNA的濃度。按TaqManMicroRNA Reverse Transcription kit逆轉錄試劑盒說明書以RNA為模板進行逆轉錄獲得cDNA并置于4℃保存，進行RT-qPCR擴增，置于RT-qPCR儀中進行測定，設置反應條件：95℃，10 min預變性；95℃變性15 s，60℃ 退火45 s，65℃延伸1 min，4℃ 10 min擴增40個循環。引物序列：miR-223上游5’-ACACTCCAGCTGGGTGTCAGTTTGTCAAATAC-3’，下游5’- TCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGGGTAT -3’；Fosl2上游5’-GAGAGGAACAAGCTGGCTGC-3’，下游5’-GCTTCTCCTTCTCCTTCTGC-3’； GAPDH上游5’-GATATTGTTGCCATCAATGAC-3’，下游5’-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3’。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內參，2-ΔΔCt法計算miR-223和Fosl2 mRNA的相對表達水平。

1.7 小鼠肝臟組織病理學檢查 處死小鼠，取小鼠肝臟組織，10%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋切片，采用HE染色5 min，用二甲苯處理后封片，置于生物顯微鏡下觀察肝臟病理變化。

1.8 油紅O染色 處死小鼠后，取小鼠肝臟組織，進行聚乙二醇和聚乙烯醇水溶性混合物(opti-mum cutting temperature compound，OCT)包埋切片，置于油紅溶液中染色30 min，37 ℃溫浴，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗3次。蘇木素染色30～60 s，1%鹽酸酒精分化，1%氨水返藍。PBS清洗3次后，用濾紙吸干殘余水分，用甘油明膠封片，置于生物顯微鏡下觀察。

1.9 Western blot實驗 取小鼠肝臟組織，剪碎，加入放射免疫沉淀法(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)蛋白裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。沸水浴中煮沸10 min，電泳后轉膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；加入一抗(1∶5 000)，4℃孵育過夜；次日PBS洗滌3次，然后加入相應二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，發光液進行顯色，選擇內參GAPDH。

2 結果

2.1 小鼠肝組織miR-223和Fosl2 mRNA表達水平比較 與正常組相比，MCD組和MCD+miR-NC組

miR-223表達水平降低，Fosl2表達水平升高(P<0.05)；與MCD組和MCD+miR-NC組相比，MCD+miR-223 mimic組中miR-223表達水平升高，Fosl2表達水平下降(P<0.05)；MCD組和MCD+miR-NC組中miR-223、Fosl2表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各小鼠肝組織中miR-223和Fosl2 mRNA表達比較

2.2 小鼠肝臟損傷指標比較 與正常組相比，MCD組和MCD+miR-NC組小鼠肝臟組織出現中或重度肝細胞空泡化和明顯肝細胞肥大的脂肪性肝炎特征；與MCD組和MCD+ miR-NC組相比，MCD+miR-223 mimic組小鼠肝臟組織肝細胞空泡化現象減少，肝細胞肥大程度降低，見圖1。與正常組相比，MCD組和MCD+ miR-NC組小鼠血清中TC、TG、ALT和AST水平上升(P<0.05)；與MCD組和MCD+miR-NC組相比，MCD+miR-223 mimic組小鼠血清中TC、TG、ALT和AST水平下降(P<0.05)。MCD組和MCD+ miR-NC組各指標差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

圖1 各組小鼠肝組織病理損傷觀察(HE染色)

表2 各組小鼠肝損傷指標比較

2.3 小鼠肝臟組織脂肪堆積情況比較 與正常組相比，MCD組和MCD+miR-NC組小鼠肝臟中出現大量的脂質滴(P<0.05)；與MCD組和MCD+miR-NC組相比，MCD+miR-223 mimic組小鼠肝臟組織中脂質滴減少(P<0.05)；MCD組和MCD+miR-NC組小鼠肝臟脂質滴差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2、表3。

圖2 各組小鼠肝臟組織脂肪堆積情況比較(油紅O染色)

表3 各組小鼠肝臟組織脂肪堆積情況比較

2.4 各組小鼠肝纖維化指標比較 與正常組比較，MCD組和MCD+miR-NC組HA、LN和Ⅳ-C水平升高(P<0.05)；與MCD組和MCD+miR-NC組相比，MCD+miR-223 mimic組HA、LN和Ⅳ-C水平降低(P<0.05)。見表4。

2.5 各組小鼠肝臟組織中蛋白表達水平比較 與正常組相比，MCD組和MCD+miR-NC組小鼠肝臟組織中Fosl2蛋白水平上升，NGP蛋白水平下降(P<0.05)；與MCD組和MCD+miR-NC組相比，MCD+miR-223 mimic組小鼠肝臟組織中Fosl2蛋白水平下降，NGP蛋白水平上升(P<0.05)。MCD組和MCD+miR-NC組蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3和表5。

表4 各組小鼠肝纖維化指標比較

圖3 各組小鼠肝組織蛋白表達電泳圖

表5 各組小鼠肝組織蛋白表達情況比較

3 討論

NASH是由于脂肪在肝臟中沉積引起的一種代謝性肝損傷疾病，與過量飲酒、肥胖和肝炎病毒感染等多種因素誘導肝臟持續性炎癥反應有關，以肝組織纖維化為主要病理特征[7-8]。進展期肝纖維化和肝硬化是NASH主要的臨床終點，探討影響NASH纖維化的機制，對預防疾病發展進程具有重要意義。

本研究采用RT-qPCR檢測小鼠肝臟組織中miR-223和Fosl2 mRNA表達情況，發現在NASH小鼠肝臟組織中miR-223低表達，Fosl2高表達。目前，miR-223在小鼠肝組織纖維化中的調控作用尚存在爭議。有研究[4]結果顯示，miR-223在長期高脂飲食喂養的小鼠肝細胞中上調，且miR-223基因缺失可以促進高脂飲食或MCD誘導的NASH以及長期高脂飲食誘導的小鼠肝癌的進展。但也有研究[9]認為，miR-223低表達可以促進肝纖維化，推進疾病惡性進展，甚至誘導肝癌發生。本研究中，miR-223在MCD模型小鼠肝臟組織中低表達，與文獻報道存在部分差異，推測與病情嚴重程度、發展進程以及模型建立方法不同有關，表明miR-223表達與NASH發展可能有關。

此外，本研究通過Western Blot檢測小鼠肝臟組織中Fosl2和NGP蛋白表達，結果顯示，NASH小鼠肝臟組織中Fosl2蛋白水平明顯上升，NGP蛋白水平下降；高表達miR-223后NASH小鼠肝臟組織中Fosl2蛋白水平下降，NGP蛋白水平上升。Fosl2屬于激活蛋白-1轉錄因子家族成員之一，參與脂肪代謝。有研究[10]顯示，Fosl2表達受多種miRNAs調控，參與脂肪的代謝過程。基于前人的研究[11]結果，結合本實驗結果，推測miR-223和Fosl2在NASH中也可能存在類似的靶向關系，影響脂代謝過程，進而影響NASH發展進程。但本研究并未深入研究兩者間的靶向關系，存在一定局限性。

NASH的病理機制復雜，其與肝脂質代謝紊亂、肝脂質過氧化增加等因素相關。本研究發現，NASH小鼠肝臟組織出現中或重度肝細胞空泡化和明顯肝細胞肥大的脂肪性肝炎特征。上調miR-223表達后，小鼠肝細胞空泡化現象明顯減少，肝細胞肥大程度降低。同時，經油紅O染色結果顯示，NASH小鼠肝臟表現出典型的脂肪性肝炎特征，出現大量脂質滴，而高表達miR-223小鼠肝臟脂質滴顯著減少，提示高表達miR-223可減輕NASH的發展進程。此外，本研究還發現，NASH小鼠血清中TC、TG、ALT和AST水平上升；上調miR-223 表達后小鼠血清中TC、TG、ALT和AST水平下降。NASH的主要特征在于脂肪在肝細胞中以含有TG的脂滴形式積累，TG積累初期可保護機體免受脂毒性的損傷，但TG積聚到超過肝臟代謝能力時可引發氧化應激反應和炎癥反應，進一步加劇肝損傷。ALT是參與人體蛋白質新陳代謝的酶，廣泛存在于人體各組織、器官中，當1%肝細胞破壞時，ALT會大量釋放入血，使血液中該酶活性顯著提高[12-13]。當AST增高超過ALT時，提示病變的慢性化和進展性。AST和ALT異常提示肝臟的炎癥反應及損傷程度。上述結果提示，NASH脂質代謝紊亂，可能是過度攝入脂肪使肝臟內脂質大量沉積，導致肝臟脂類代謝能力減弱，進而發生炎癥使肝細胞壞死甚至纖維化，上調miR-223表達在一定程度上改善了NASH小鼠臟臟脂類代謝能力。NASH患者通常伴有肝細胞損傷，可導致進展性肝纖維化，本研究通過檢測各組小鼠肝纖維化指標評估miR-223對肝纖維化的影響。結果顯示，NASH小鼠血清中HA、LN和Ⅳ-C水平高于正常小鼠，而高表達miR-223后，小鼠血清中HA、LN和Ⅳ-C水平降低，提示高表達miR-223可能改善NASH小鼠肝纖維化情況。本研究結果提示，高表達miR-223可能通過調控Fosl2/NGP通路影響NASH進程。

綜上所述，本研究初步分析高表達miR-223改善NASH小鼠模型脂質代謝、降低肝纖維化指標水平、改善肝臟損傷，可能與Fosl2/NGP通路有關。