肝素鈉對白蛋白檢測的干擾實驗分析

田國亮，李有杰

（1.濱州醫學院基礎醫學院，山東 煙臺 264003；2.淄博市第一醫院檢驗科，山東 淄博 255200）

目前檢驗科主要使用血清或者血漿標本來定量檢測白蛋白濃度，如羅氏公司《白蛋白檢測試劑盒說明書》中提到可以使用血清或者肝素鋰、K2-EDTA血漿檢測白蛋白；而貝克曼庫爾特公司《白蛋白測定試劑盒（溴甲酚綠法）使用說明書》中提到僅可使用血清標本檢測此項目。既往有報道顯示[1-3]，血漿標本與血清標本檢測白蛋白的結果有差異。本研究根據中華人民共和國衛生行業標準WS/T 416-2013《干擾實驗指南》文件，評價肝素鈉對溴甲酚綠法檢測人血清白蛋白的干擾效應，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 樣本來源 收集淄博市第一醫院2020 年12 月臨床未使用肝素鈉藥物的患者的混合血清作為樣本來源，根據《干擾實驗指南》附錄B：常見被測量的建議實驗濃度和ALB的醫學決定水平[4]，共收集3 個濃度，分別為25、35 和50 g/L。

1.2 儀器和試劑 全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特有限公司，型號：AU5800）；白蛋白測定試劑盒（美國貝克曼庫爾特有限公司，批號AUZ8181）與配套校準物（批號1121M）。檢測前儀器功能正常，質控在控。

1.3 干擾物儲存液配制 取用肝素鈉注射液（江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司，規格：2 ml∶12 500 U），加去離子水8 ml 至溶液總容積為10 ml，使肝素鈉濃度稀釋為1250 U/ml[5]。

1.4 干擾物篩查實驗（配對差異實驗）

1.4.1 樣本制備 ①基礎樣本：取ALB 濃度分別為25、35 和50 g/L的血清作為基礎樣本液；②測試樣本：實驗樣本與對照樣本制備方法見表1。實驗樣本中基礎樣本與干擾物儲存液的比例為19∶1，其中肝素鈉濃度為62.5 U/ml；對照樣本中基礎樣本與生理鹽水的比例為19∶1，其中肝素鈉濃度為0 U/ml。

表1 實驗樣本與對照樣本的制備（μl）

1.4.2 確定干擾判斷標準 本實驗基于ALB 總誤差6%[6]的1/3，即2%偏倚作為最大允許干擾值dmax。

1.4.3 測定重復次數 依據《干擾實驗指南》，計算出最大允許干擾值dmax與批內重復性標準差s的比值，其中s由基礎樣本重復檢測20 次計算而得[7]。通過查表得出ALB 不同濃度水平的重復測定次數。

1.4.4 檢測要求 為避免攜帶污染，將實驗樣本T和對照樣本C 按交互順序檢測，中間插入額外檢測的對照樣本CX，標本按如下順序檢測：C1T1CXCXC2T2CXCX……CnTn。

1.4.5 數據處理與分析 ①干擾效果dobs的計算：干擾效果dobs=實驗樣本測定均值（xtest）-對照樣本測定均值（xcontrol）[8]；②計算臨界值，式中dnull為無效假設的值，通常為0；s 為批內標準差，Z（1-α/2）為相對于雙邊檢驗100（1-α）%可信區間時正態分布的百分位點，n為重復測定次數。

1.5 干擾物劑量效應評價實驗

1.5.1 樣本制備 ①基礎樣本：取ALB 濃度分別為25、35 和50 g/L的血清作為基礎樣本液；②含不同劑量干擾物的測試樣本：干擾物高實驗濃度樣本制備方法參見1.4.1 中實驗樣本的制備，其肝素鈉終濃度為62.5 U/ml。干擾物低實驗濃度樣本的制備參見1.4.1中對照樣本的制備，其肝素鈉終濃度為0 U/ml；③將肝素鈉終濃度為62.5 U/ml的測試樣本與肝素鈉終濃度為0 U/ml的測試樣本，按照0∶4、1∶3、1∶1、3∶1、4∶0的比例進行配制，可得到肝素鈉濃度依次遞升的5 個濃度水平實驗樣本，具體制備方法見表2。

表2 肝素鈉不同濃度水平樣本的制備

1.5.2 測試重復次數 共測定5 次，排除方法精密度對結果的影響。

1.5.3 劑量效應分析 計算樣本中肝素鈉濃度為0 U/ml的實驗樣本的測定均值，用肝素鈉濃度依次遞升的5 個濃度水平實驗樣本的每個測定值減去此均值，得出不同肝素鈉濃度水平下的干擾效果。以干擾效果為Y 值，肝素鈉濃度為X 值，利用SPSS 24.0 軟件描繪散點圖。如果散點圖上數據成近似直線走向，則用線性回歸進行分析，計算回歸方程；如果散點圖上數據顯示非線性，則使用非線性回歸來評估干擾物的劑量效應。

2 結果與分析

2.1 干擾物篩查實驗（配對差異實驗）

2.1.1 重復次數的確定 3 個濃度基礎樣本20 次測定的ALB 均值分別為24.69、34.49、49.59 g/L，dmax分別為0.49、0.69、0.99 g/L，s分別為0.14、0.23、0.33；3 個濃度ALB的dmax/s 均≥3，確定測定次數均為3 次。

2.1.2 干擾效應分析 3 個濃度ALB的dobs分別為-1.1、-1.03、-0.77，dc分別為0.16、0.26、0.37，∣dobs∣＞dc，表明3 個濃度下，62.5 U/ml的肝素鈉對ALB 測定均存在干擾。

2.2 劑量效應實驗 將干擾效果（Y）、干擾物濃度（X）等數據輸入SPSS 24.0 軟件中，繪制出干擾物劑量相關曲線。由曲線可知，肝素鈉對3 個濃度下ALB 測定產生線性負干擾，見圖1～圖3；低、中、高3 個濃度ALB的線性回歸方程結果顯示，肝素鈉在3 個ALB 濃度下均與干擾效果存在線性回歸關系（t=7.100、12.280、4.130，P＜0.001）；代入線性公式計算得，在肝素鈉濃度＜3.19 U/ml 時不會對低濃度ALB 測定產生干擾；在肝素鈉濃度＜17.42 U/ml 時不會對中濃度ALB 測定產生干擾；在肝素鈉濃度＜30.86 U/ml 時不會對高濃度ALB 測定產生干擾。

圖1 肝素鈉對低濃度ALB 干擾的劑量效應曲線

圖2 肝素鈉對中濃度ALB 干擾的劑量效應曲線

圖3 肝素鈉對高濃度ALB 干擾的劑量效應曲線

3 討論

ALB 是人體血漿中含量最為豐富的蛋白質，占總蛋白的57%～68%。其為人體重要的營養蛋白，并參與維持酸堿平衡、維持血漿膠體滲透壓，能保持人體內環境的穩定，還能轉運血漿中多種物質[9]。在腎病患者中，白蛋白檢測可以評估患者的預后情況，而且是透析患者護理質量的一項評價指標。白蛋白還可作為健康老年人預測死亡率的因素[10]。人血清白蛋白濃度也被用來通過佩恩公式估計校正后的鈣水平，從而減少對鈣濃度的錯誤估計[11]。目前，人體內白蛋白的檢測方法主要有蛋白電泳法、染料結合法（包括溴甲酚綠法和溴甲酚紫法) 和免疫比濁法[12]；其中溴甲酚綠法為大多數全自動生化分析儀配套的檢測方法，其檢測成本低廉，精密度高，線性范圍寬，適用于大部分的患者[13]。但由于一些已知或不明原因，溴甲酚綠法ALB 檢測會存在其他非白蛋白類物質的非特異干擾，影響檢測結果的準確性[14-16]。該項目的測量誤差可造成臨床醫生對患者身體狀況的評估失誤，甚至影響對患者的治療。

肝素是一種帶有強大負電荷的粘多糖硫酸酯，因首先從肝臟中發現而得名，其平均分子量為15 KDa，呈強酸性。肝素也存在于肺、血管壁、腸粘膜等組織中，是動物體內一種天然抗凝血物質。肝素天然存在于肥大細胞，現在主要從牛肺或豬小腸黏膜提取。其作為一種抗凝劑已有90 多年的歷史[17]，是由兩種多糖交替連接而成的多聚體，在體內外都有抗凝血作用，是世界上使用最廣泛的臨床抗凝劑。肝素通過與抗凝血酶Ⅲ相互作用來抑制血栓形成。臨床上主要用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手術、心臟導管檢查、體外循環、血液透析等。隨著藥理學及臨床醫學的進展，肝素的應用不斷擴大。在臨床中主要用其肝素鈉或者肝素鈣的水溶液。

檢測方法的總誤差包括不精密度、方法特異性偏倚和樣本特異性偏倚[18]。干擾物既能引起系統誤差，也會造成隨機誤差。對于某些方法，干擾效果的影響超過了不精密度，就成為隨機誤差的主要來源。從患者個體來說，干擾物引起的檢測誤差隨著患者樣本中干擾物濃度的改變而改變。

通過參考《干擾實驗指南》，用將潛在干擾物添加到樣本中的方式來評價干擾效應，篩選、證實、量化潛在的干擾物質，明確檢測方法對干擾物質的敏感性，及時作出風險評估，必要時發布特殊的聲明或警示以提醒臨床。

由干擾物篩查實驗（配對差異實驗）、劑量效應實驗結果可知，62.5 U/ml 肝素鈉會對ALB 低、中、高3 個濃度測定產生負干擾。其原因可能為肝素是一種帶有強大負電荷的粘多糖硫酸酯，在到達一定濃度時可能與ALB 測定試劑中帶陰離子的溴甲酚綠染料競爭帶正電荷的ALB 分子（pH 4.2）的結合位點，使ALB 與染料結合減少，導致ALB 測定結果偏低[19]。

綜上所述，肝素鈉作為干擾物質，對ALB 測定的影響隨著ALB 濃度的增加而減弱。目前臨床常規生化分析多采用血清標本進行檢測。但是對于臨床使用肝素鈉藥物的患者，尤其對于留置管采血時混入肝素的透析患者，要注意其ALB 結果的準確性，特別是在ALB 濃度偏低時，必要時檢驗人員應予以說明。