金針菇菌渣發酵條件的優化

陳 明，陳 鵬，王 靜，宋春雷，黃克和

（1. 南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京 210095；2. 江蘇農林職業技術學院，江蘇 鎮江 212400）

隨著我國畜牧業的不斷發展，優質粗飼料資源短缺，高效利用飼料原料、開發新的飼料資源迫在眉睫。我國是食用菌生產大國，2019年食用菌生產總量為3.96×108t[1]。每100 g 基質料生產鮮菇可產生60 g 菌渣，每年約產生2.37×108t菌渣[1-2]。目前，食用菌菌渣的處理方法主要是丟棄或焚燒，會造成資源浪費、污染環境[3]。菌渣來源廣泛，富含粗蛋白質、粗脂肪、粗纖維、微量元素、氨基酸及其他營養成分[4]。菌渣具有特定香味，顆粒小或呈粉末狀，適口性、可消化性較好，可直接或加工后飼喂畜禽，是潛在的飼料資源[3]。但菌渣也含有一些有害物質，如霉菌毒素、單寧等，直接飼喂動物可能會阻礙動物的生長發育，降低生產性能[5]。呂文婷等[6]研究發現，在AA肉雞配合飼料中添加少量平菇菌糠可提高日增重，降低料重比，提高經濟效益。張書良等[7]研究發現，在肉鵝飼料中添加不同比例的杏鮑菇菌渣可提高肉鵝日增重和經濟效益。郭萬正等[8]在波爾山羊基礎日糧中添加發酵金針菇菌糠，結果顯示，各組生長性能無顯著差異，生理生化指標均無顯著差異。

固態發酵指在固態基質中的微生物發酵，發酵基質中幾乎沒有可以自由流動的水[9]。固態發酵具有可保持微生物原始的生長狀態、利于發酵代謝產物的積累與多樣性、培養基質含水量低、不需要液態發酵的廢水處理、環境友好、生產成本低等優點[10]?？莶菅挎邨U菌的芽孢營養體易保存，可作為微生物飼料的發酵菌種[10-12]?？莶菅挎邨U菌在生長代謝過程中能夠分泌大量抗菌肽、α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等活性物質，能夠促進畜禽營養吸收轉化率，增強機體免疫力，可利用枯草芽孢桿菌的發酵特性提升飼料的消化利用率。本試驗采用枯草芽孢桿菌發酵金針菇菌渣的固態發酵方法優化發酵條件，旨在獲得適口性較好的微生物飼料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種復壯

枯草芽孢桿菌菌種由江蘇農林職業技術學院畜牧獸醫學院益生菌研究組提供。

將冷凍的枯草芽孢桿菌種接種至牛肉膏蛋白胨液體培養基，恒溫振蕩培養，傳代3次復壯，4 ℃保存，枯草芽孢桿菌菌液活菌數量為1×107CFU/mL。

1.1.2 菌渣

新鮮金針菇菌渣由南京金萬辰生物科技有限公司提供，金針菇生產培養基質原料組成見表1。鮮金針菇菌渣主要化學成分及有關指標見表2。

表1 金針菇生產培養基質原料組成Tab.1 Substrate composition of Flammulina velutipes production culture medium 單位：%

1.1.3 培養基

液體培養基：牛肉膏3 g、氯化鈉5 g、蛋白胨10 g、蒸餾水1 000 mL，加熱攪拌，校正pH值至7.2～7.4，121.3 ℃高壓滅菌30 min，倒入錐形瓶，冷卻，4 ℃保存。

表2 鮮金針菇菌渣主要化學成分及相關指標Tab.2 Proportion of chemical composition and related indexes in fresh Flammulina velutipes residue

固體培養基：牛肉膏3 g、氯化鈉5 g、蛋白胨10 g、瓊脂粉25 g、蒸餾水1 000 mL，加熱攪拌，校正pH值至7.2～7.4；121.3 ℃高壓滅菌30 min，倒入玻璃培養皿，冷卻凝固后倒置，4 ℃保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 單因素試驗

探究枯草芽孢桿菌發酵金針菇菌渣的接種比例、發酵時間、發酵溫度等影響因素。將發酵產物稀釋至106倍，涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養基，37 ℃培養24 h，測定枯草芽孢桿菌活菌數量，探究各因素的最適條件范圍。

1.2.1.1 菌渣發酵的最佳接種比例

試驗分兩次進行，探究枯草芽孢桿菌發酵金針菇菌渣的水分需求以及菌種接種比例。

第1次試驗，無菌玻璃培養皿編號1～6，分別加入0、2、4、6、8、10 mL蒸餾水，各加2 mL枯草芽孢桿菌液和10 g金針菇菌渣，混勻，37 ℃培養24 h，觀察發霉情況。

第2次試驗，無菌玻璃培養皿編號0～6，分別加入0、1、2、3、4、5、6 mL枯草芽孢桿菌液和10 g金針菇菌渣，混勻，37 ℃培養24 h，觀察發霉情況。

1.2.1.2 菌渣發酵的最佳溫度

采用不同溫度（31、34、37、40 ℃），發酵時間24 h，枯草芽孢桿菌液與金針菇菌渣接種比例為5∶10 mL/g，菌渣混合液初始pH值為7.0，每組5個重復。

將發酵產物稀釋至106倍，涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養基，37 ℃培養24 h，觀察發霉情況并測定枯草芽孢桿菌數量。

1.2.1.3 菌渣發酵的最適時間試驗分兩次進行。

第1 次試驗繪制枯草芽孢桿菌在菌渣中的生長曲線，初步了解培養時間。枯草芽孢桿菌液與菌渣的接種比例為5∶10 mL/g，菌渣混合物初始pH 值為7.0，溫度34 ℃，分別培養0、4、8、12、16、20、24、28、32 h；采取不同時間點的發酵產物稀釋至106倍，涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養基，37 ℃培養24 h，測定枯草芽孢桿菌數量。

第2次試驗根據第1次試驗的結果明確培養時間。采用不同培養時間（16、20、24、28 h），溫度34 ℃，枯草芽孢桿菌液與金針菇菌渣接種比例為5∶10 mL/g，菌渣混合液初始pH值為7.0，每組5個重復；發酵產物稀釋至106倍，涂布于牛肉膏蛋白胨培養基，37 ℃培養24 h，測定枯草芽孢桿菌數量。

1.2.2 正交試驗

根據單因素試驗結果，通過L9（33）正交試驗和曲線回歸分析確定接種比例、發酵溫度、發酵時間對發酵效果的影響程度及最適發酵條件。

正交試驗因素水平見表3。

表3 L9（34）正交試驗因素水平設計Tab.3 L9(34)orthogonal test factor level design

1.3 數據統計與分析

采用Excel 2016 軟件對試驗數據進行處理，繪制不同發酵時間細菌生長分布圖，采用SPSS 軟件進行多因素方差分析和二次曲線回歸分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 接種比例的確定

第1 次試驗加入蒸餾水菌渣培養后，均有較多霉菌長出，不加蒸餾水的培養后霉菌較少或未見；第2次試驗不加蒸餾水，不同接種比例的培養結果見表4。

根據兩次試驗結果分析，初步推斷，金針菇菌渣發酵的枯草芽孢桿菌液與金針菇菌渣比例為4∶10～6∶10 mL/g時，發酵效果較好。

2.1.2 發酵溫度的確定（見圖1）

由圖1 可知，枯草芽孢桿菌液與菌渣的接種比例為5∶10 mL/g，菌渣混合物于初始pH 值為7.0，發酵時間24 h條件下，34、37 ℃細菌生長情況優于31、40 ℃，4種發酵溫度下均未見發霉現象，初步確定發酵最適溫度范圍為34～37 ℃。

表4 不同接種比例的培養結果Tab.4 Cultural results influenced by different inoculated proportion

2.1.3 發酵時間（見圖2、圖3）

由圖2 可知，枯草芽孢桿菌培養4 h 后進入對數生長期，16 h后生長速度減慢，16～24 h為穩定期，24 h后進入衰退期。

圖2 菌渣中不同時間枯草芽孢桿菌生長曲線Fig.2 Growth curve of Bacillus subtilis in different duration points

由圖3可知，20、24 h的細菌生長情況優于16、28 h，故確定發酵時間范圍為20～24 h。

通過單因素試驗，初步確定菌渣發酵的枯草芽孢桿菌液與金針菇菌渣的最佳比例為4∶10～6∶10 mL/g，最適發酵溫度為34～37 ℃，最適發酵時間為20～24 h。

2.2 正交試驗結果（見表5、表6）

圖3 不同發酵時間的細菌數量Fig.3 Number of bacteria colonized in different fermented duration

表5 正交試驗結果Tab.5 Results of orthogonal test

由表5可知，接種比例對固態發酵中枯草芽孢桿菌的活菌數量影響最大，其次是發酵時間，發酵溫度影響最小。

表6 正交試驗方差分析Tab.6 Analysis of variance of orthogonal test

由表6可知，發酵時間、發酵溫度、接種比例為活菌量的99.4%變化原因，其中，接種比例對活菌量有極顯著影響（P＜0.01），發酵時間對活菌量有顯著影響（P＜0.05），發酵溫度對活菌量不顯著。

各因子對發酵效果影響程度：接種比例＞發酵時間＞一定范圍內的發酵溫度，與極差分析結果一致。

2.3 最適條件曲線回歸分析（見圖4～圖6）

由圖4可知，發酵時間為24 h時，枯草芽孢桿菌活菌量最多，效果最佳。

圖4 發酵時間與活菌量的擬合曲線Fig.4 Fitting curve on fermented duration and number of live bacteria

由圖5可知，在一定范圍內，發酵溫度對發酵效果無明顯影響。

圖5 發酵溫度與活菌量的擬合曲線Fig.5 Fitting curve on fermented temperature and number of live bacteria

由圖6 可知，枯草芽孢桿菌液與金針菇菌渣的比例為6∶10 mL/g時效果最佳。

圖6 接種比例與活菌量的擬合曲線Fig.6 Fitting curve on inoculated proportion and number of live bacteria

確定最適發酵條件為發酵時間24 h、發酵溫度34 ℃、枯草芽孢桿菌液與金針菇菌渣的比例為6∶10 mL/g。

2.4 最適發酵條件的驗證（見圖7、圖8）

由圖7可知，最適發酵條件下，發酵產物稀釋至106倍，涂布于牛肉膏蛋白胨培養基，37 ℃培養24 h，發酵后細菌生長良好，分布均勻，菌落大小正常，無霉菌生長。

由圖8可知，經革蘭氏染色無雜菌污染。

圖7 枯草芽孢桿菌菌落生長情況Fig.7 Colony growth of Bacillus subtilis

圖8 枯草芽孢桿菌鏡檢Fig.8 Microscopic test on Bacillus subtilis

2.5 發酵產物活菌數量和衛生指標的測定

在最適發酵條件下，測得發酵菌渣產物中活菌數量為7.5×108CFU/g，符合發酵飼料生產技術規程的要求（TQBAA 001—2009）[12]。有毒有害物質黃曲霉毒素B1的含量＜0.15 μg/kg，符合國家飼料衛生標準的要求（GB 13078—2017）[13]。

3 討論

3.1 細菌生長營養需求

新鮮金針菇菌渣水分含量為55.26%，枯草芽孢桿菌菌液與菌渣比例為6∶10 mL/g的混合物水分含量為64.33%，發酵產物水分含量為64.13%，表明枯草芽孢桿菌發酵金針菇菌渣的水分含量充足。菌渣自身的麩皮、玉米、細米糠、棉籽殼、菌絲體等富含碳源和氮源，能夠滿足枯草芽孢桿菌生長需求。菌渣菌液混合物的初始pH值約為7.0，不需再做調整，更接近生產實際，適合規?；a。

3.2 固態發酵與條件

細菌生長的主要影響因素為培養基營養、水分含量、初始pH 值、外界溫度及培養時間。本研究采用益生菌于無游離水基質上的固態發酵方式，發酵中產生的熱量可促進水分蒸發，利于保持發酵產物的低水分含量[14]，也可減少水分含量高引起發霉的現象，方便后期烘干貯藏和直接飼喂或與其他飼料混合。

不同接種菌液的比例導致固態發酵中水分含量不同，對枯草芽孢桿菌的生長結果具有一定影響?？莶菅挎邨U菌液與金針菇菌渣的接種比例為6∶10 mL/g 時，發酵效果較好，霉菌生長受到抑制；降低接種比例時，桿菌生長較好但無法有效抑制霉菌生長。

培養時間可影響細菌生長?？莶菅挎邨U菌在液態培養基中適應期約為6 h，且固態發酵中水分和營養成分均低于液態培養基。本研究中金針菇菌渣發酵的適應期延長，培養4 h 后進入對數生長期；隨著菌渣中營養被利用，培養至22 h 時，生長速度進入穩定期，24 h 后細菌數量不再上升。

培養溫度液可影響細菌生長，一般細菌適宜生長溫度為37 ℃。菌渣固態發酵時，可產生一定的熱量；枯草芽孢桿菌抗逆性強，發酵溫度為34 ℃時，繁殖速度及數量與37 ℃無顯著差異，與文獻報道一致[15]。

4 結論

枯草芽孢桿菌發酵金針菇菌渣最適發酵條件為發酵溫度34 ℃、發酵時間24 h、枯草芽孢桿菌菌液與金針菇菌渣接種比例為6∶10 mL/g，活菌數符合發酵飼料生產技術規程要求，黃曲霉毒素含量符合飼料衛生標準要求。