正常血鎂Gitelman綜合征1例的臨床表現及基因診斷分析

周建華，李曉華，張宏利

上海中醫藥大學附屬第七人民醫院內分泌代謝科，上海 200137

Gitelman 綜合征是由編碼噻嗪類敏感的Na+/Cl－共轉運蛋白（thiazine-sensitive NaCl cotransporter，NCCT）的SLC12A3基因突變引起的常染色體隱性遺傳的腎小管疾病，以低血鉀、低血鎂、低尿鈣和繼發性醛固酮增多癥為主要特征。據報道，其發病率為1/40 000～10/40 000，在亞洲更為多見［1］。因其起病隱匿，在臨床中易被忽視或誤診。本研究報道1 例正常血鎂Gitelman綜合征并做文獻復習，旨在提高臨床醫師對該病的認識和診治水平。

1 病例資料

1.1 一般病史

患者男性，33 歲，因“發熱伴四肢麻木1 d”就診于上海中醫藥大學附屬第七人民醫院急診，當時查血鉀2.78 mmol/L，給予補鉀治療后手足麻木緩解。后因“反復右手第二指指間關節疼痛4 年”就診于上海中醫藥大學附屬第七人民醫院內分泌科，再次發現血鉀偏低，血鉀2.94 mmol/L。追問病史，患者無乏力、手足麻木、手足抽搐、雙下肢軟癱、多尿、嗜鹽等癥狀，僅于發熱時自覺手足麻木，發熱緩解后手足麻木可自行緩解，無慢性腹瀉及嘔吐史，無噻嗪類利尿劑及瀉藥服用史。父親母親均體健。發病以來，飲食睡眠可，大小便正常，體質量無變化。

體格檢查：體溫36.8 ℃，脈搏80 次/min，呼吸18次/min，血壓100/70 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），體質量71.1 kg，身高165 cm，體質量指數（body mass index，BMI）26.1 kg/m2。正常體型。心肺腹（-），脊柱四肢無畸形，雙下肢無水腫。四肢肌力肌張力正常，四肢活動自如。生理反射存在，病理反射未引出。右手第二指指間關節紅腫熱痛。

實 驗 室 檢 查： 血 鉀2.94 mmol/L， 血 鈉139 mmol/L， 血 氯100 mmol/L， 總 二 氧 化 碳31.5 mmol/L，血鈣2.43 mmol/L，血磷1.41 mmol/L，血鎂0.76 mmol/L。24 h 尿中，尿鉀39.1 mmol，尿鈉329.0 mmol，尿鈣0.6 mmol（正常值2.5～7.5 mmol），尿肌酐12.4 mmol，尿酸2 128.0 μmol，尿微量白蛋白7.7 mmol，尿蛋白84.70 mg，尿pH 5.5。立位腎素31.64 pg/mL，立位血漿醛固酮197.98 pg/mL。血尿素氮4.69 mmol/L， 血 肌 酐64.1 μmol/L， 血 尿 酸586.2 μmol/L。葡萄糖耐量試驗示空腹葡萄糖4.80 mmol/L，2 h 血糖4.65 mmol/L，糖化白蛋白11.2%，糖化血紅蛋白5.0%。血促腎上腺皮質激素56.84 pg/mL，血皮質醇18.43 μg/dL。甲狀腺功能及抗體正常。自身免疫抗體13項正常。

泌尿系彩超、雙腎上腺增強CT 均未見異常。右手雙能CT見第二指指間關節旁痛風石（圖1）。

1.2 基因診斷

使用Illumina hiseq2500 二代DNA 測序方法對SLC12A3、CLCNKB基因進行了測序分析，發現先證者在SLC12A3基因8號外顯子和15號外顯子分別存在1個雜合突變位點，并分別來源于母親和父親［exon8：c.1084G>A（圖2）。exon15：c.1850A>G（圖3）］。對其進行一代Sanger法驗證，SLC12A3基因上游引物5'-TCAGTGGGCTGGATG-CAGAGACG-3'，下 游 引 物5'-GGGAAGAACAGGAT-TCAGGCAAGCTGG-3'，產物1 455 bp。結果確認此2個位點突變。此2個突變使相鄰的2 個氨基酸密碼子發生錯義突變：p.G362S，p.Q617R。2種變體均位于NCCT蛋白的細胞內結構域，其中一種變體位于羧基末端區域（圖4）。在dbSNP135及1000 genomes project數據庫中，突變p.G362S 未見記錄，突變p.Q617R 頻率極低。而在gnomAD 正常人數據庫（ACMG-PM2）里，本研究發現的2個變異均未見記錄，迄今為止也沒有文獻報道。根據ACMG基因變異致病性評估指南，這2個變異被分類為臨床意義未明變異。

圖2 SLA12A3基因外顯子8檢測到的致病突變c.1084G>AFig 2 Pathogenic mutation c.1084G>A detected in exon 8 of SLA12A3 gene

圖3 SLA12A3基因外顯子15檢測到的致病突變c.1850A>GFig 3 Pathogenic mutation c.1850A>G detected in exon 15 of SLA12A3 gene

圖4 預測NCCT突變的拓撲定位Fig 4 Predicted topological localization of NCCT mutations

1.3 計算機輔助鑒別有害的變異體

SIFT 和PROVEAN 軟件是2款用于評估研究中發現的外顯子區變異是否有損于蛋白質功能的常用工具程序。SIFT 軟件輸出的分值區間為0～1，當變異體得分≤0.05 時判定為有害的（damaging），>0.05 時則判定為可接受的（tolerated）。PROVEAN 軟件對位點保守性的評分若≤-2.5， 則判定為有害的影響（deleterious）。本研究中發現的錯義突變p.G362S，應用SIFT 軟件得分為0，應用PROVEAN 軟件得分為-5.44，被判定為有害的變異；錯義突變p.Q617R，應用SIFT 軟件得分為0，應用PROVEAN 軟件得分為-3.86，被判定為有害的變異。

1.4 基因突變后蛋白質結構預測

通過將SLC12A3基因運用Swiss model預測其蛋白結果發現，變異后將會使其三維結構發生改變（圖5）。

圖5 蛋白質結構預測圖Fig 5 Predicted structure of the protein

1.5 診治及隨訪

診斷：①Gitelman綜合征。②痛風性關節炎急性發作期。治療：①補鉀治療。予口服氯化鉀緩釋片1.0 g/次，3 次/d。②消炎止痛治療。予秋水仙堿片0.5 mg/次，3 次/d，疼 痛 緩 解 后 調 整 為0.5 mg/次，1次/d。隨訪：患者1 d后右手指間關節疼痛緩解，1周后復查血鉀3.10 mmol/L，2 周后加用苯溴馬隆膠囊50 mg/次，1次/d，1個月后復查血鉀3.22 mmol/L，血鎂0.80 mmol/L，血尿酸287.0 μmol/L，患者無不適。

2 討論

Gitelman 綜合征又稱家族性低鉀低鎂血癥，臨床表現有嗜鹽、抽搐、肌肉無力、乏力，多尿、關節痛、軟骨鈣質沉著癥、生長遲緩等等，其臨床表現主要與低鉀血癥和低鎂血癥有關。而SLC12A3的雙等位基因失活突變確定是確診Gitelman 綜合征的金標準［2］。也有報道［3］稱18%～40%的疑似Gitelman綜合征患者僅發現了單等位基因突變，不符合常染色體隱性遺傳規律；推測與基因重組后出現大片段的結構異常有關，而目前二代測序的方法對于大片段的缺失或重復缺乏相應的檢測敏感性。

本例Gitelman綜合征患者血鎂水平正常，并且無乏力、嗜鹽、抽搐、多尿等相關臨床癥狀，僅于發熱時出現四肢麻木，臨床相對少見，需要與Bartter綜合征相鑒別。本病例低尿鈣以及二代測序未發現CLCNKB基因突變的臨床特點均支持Gitelman綜合征診斷。有報道稱，Gitelman綜合征的臨床表現的嚴重程度與血鎂的水平呈負相關［4-5］。血鎂水平降至0.5 mmol/L 以下才導致顯著的癥狀和體征，臨床表現包括神經肌肉過度興奮、震顫、抽搐和昏迷［6］。腕部痙攣或手足抽搐被認為是由于低鎂血癥引起［7］，血鎂正常的Gitelman綜合征患者表現為較低頻率的腕部痙攣或手足抽搐，以及較輕的電解質紊亂，代謝性堿中毒和腎素-血管緊張素-醛固酮系統（reninangiotensin-aldosterone system，RAAS） 的 激 活［4］。本病例患者無相關自覺臨床癥狀，考慮與血鎂水平正常有關。已有報道［8-11］顯示8%～22%的Gitelman 綜合征患者血鎂正常。目前，Gitelman綜合征低鎂血癥的發病機制仍不明確。鎂是細胞內第二豐富的陽離子，在多種生物活性中發揮著重要作用。血鎂濃度與腸吸收密切相關，主要由腎排泄調節。雖然遠曲小管通過瞬時受體電位蛋白酶抑制素6 亞型（transient receptor potential cation channel subfamily M，member 6，TRPM6）介導只吸收超濾液中5%～10%的鎂離子，但它是吸收鎂離子的最后一個部位，起到調節尿鎂濃度的作用，因此它決定了最終的血鎂濃度。TRPM6突變的發現是家族性低鎂血癥繼發性低鈣血癥的原因，闡明了TRPM6 可滲透性通道缺陷表達的特征［12］。NIJENHUIS 等［13］在一項對NCCT 缺陷小鼠的研究中發現，遠曲小管TRPM6 的表達減少可能是造成低鎂血癥的原因。JIANG 等［4］在一個32 例的Gitelman綜合征患者的隊列研究中發現，低鎂血癥組TRPM6 表達較正常對照組明顯下調，而正常血鎂組TRPM6 表達較正常對照組無顯著差異。也有研究表明，性別可能影響Gitelman 綜合征患者的血清鎂水平。LIN 等［14］報道了2 個病例證實為Gitelman 綜合征的家系，其中男性患者血鎂正常，而具有相同突變的女性患者血鎂過低。也有學者認為，Gitelman綜合征患者的血漿游離鎂濃度比總鎂濃度更有意義。TOSI等［15］發現血漿總鎂濃度正常的Gitelman綜合征患者血漿游離鎂濃度是降低的，且血漿游離鎂濃度與血漿碳酸氫鹽之間存在顯著相關性，但血漿游離鎂濃度因檢測手段等問題未能在臨床廣泛開展。

本病例的另一個特點是合并痛風性關節炎。已有報道顯示，Gitelman 綜合征合并假性痛風性關節炎，考慮為軟骨鈣質沉著癥，這可能是因為尿鈣排泄減少，增加了鈣鹽結晶沉積的概率，同時因為代謝性堿中毒及低鎂血癥導致焦磷酸酶活性下降，阻礙焦磷酸水解為無機的磷酸鹽，加重焦磷酸鹽結晶，沉積于關節周圍并引起關節痛［16］。但Gitelman 綜合征合并痛風性關節炎尚未見報道。MAIOLINO 等［17］檢測了25 例Gitelman 綜合征患者的血尿酸水平，結果發現所有患者的血尿酸水平均在正常范圍，并且男性血尿酸平均水平高于女性。也有報道［18-19］顯示Gitelman綜合征患者合并低血尿酸水平。本例患者合并高尿酸血癥，24 h 尿尿酸水平為2 128.0 μmol，尿酸排泄分數（血肌酐×24 h 尿酸/血尿酸×24 h 尿肌酐） 為1.88%，提示患者為尿酸排泄減少型高尿酸血癥，考慮可能仍與NCCT 失活有關?；颊哌h曲小管NCCT 失活，致遠曲小管NaCl 重吸收減少，血容量下降，腎血流量代償性增加，近曲小管NaCl 和尿酸鹽重吸收增加。而鈉和尿酸鹽關聯的具體機制尚不完全明確，有研究表明［20］，血容量不足和限鹽攝入均可增加尿酸鹽的重吸收，可能與近曲小管鈉和尿酸鹽的重吸收之間存在平行關系有關。尿酸鹽通過多種陰離子交換蛋白進入細胞，包括尿酸鹽-羥基交換蛋白和尿酸鹽-乳酸交換蛋白，這2 個過程都依賴于鈉的轉運。而管腔膜上的Na+-H+交換蛋白負責大多數的近端碳酸氫鹽重吸收。當鈉重吸收增加時，Na+-H+交換增加，碳酸氫鹽重吸收增加，細胞內環境比管腔內的堿性更強，細胞內較高的羥基濃度為羥基排出提供了有利梯度，羥基排出進而可促進尿酸鹽重吸收。同樣，當鈉重吸收增加時，管腔膜上的鈉-乳酸協同轉運蛋白可介導乳酸進入細胞，這些乳酸隨后通過尿酸鹽-乳酸交換蛋白返回管腔，而尿酸鹽被重吸收。

Gitelman 綜合征的基因型中，純合子基因型僅占18%，雜合子基因型占45%，復雜雜合子基因型占67%［21］。其基因型和表型的相關性研究有助于進一步了解NCCT 的功能，并為臨床診治提供參考。然而，基于不同研究的結果的不一致性，目前Gitelman綜合征基因型與表型之間的關系尚不清楚。1996 年，Simon 等克隆了SLC12A3的cDNA，首次對人類NCCT進行了編碼，并將其定位在具有26個獨立外顯子的人染色體16q13 上。NCCT 是腎遠曲小管的主要離子轉運系統，由1 021 個氨基酸殘基組成，預測細胞內12 個跨膜結構域和較長的氨基和羧基端?，F已發現［22］SLC12A3基因突變類型共有529 種，以錯義突變及無義突變最多見，缺失突變和剪接位點突變較常見，插入突變較少見，另外還有插入缺失突變和復雜的基因重排等。一項納入了137 例中國Gitelman 綜合征患者的研究顯示［23］，在發現的90 個突變中，錯義突變占72%以上。T60M 及D486N 是中國患者最常見的氨基酸突變［9，11］，而IVS9+1G>T 是報道最多的歐洲人群中常見的突變［24］。在已發現的突變中，運用爪蟾卵母細胞表達系統僅對其中大約50 個突變進行了功能分析。研究發現，突變位點、突變類型、突變個數以及突變位置均影響臨床表型。比如一些關鍵位點（糖基化位點和磷酸化位點）的突變可以直接影響NCCT 的活性及穩定性［25-27］，一些特殊位點的突變臨床表型相對較輕，剪切突變、無義突變、移碼突變、無功能性錯義突變導致的臨床表型較重［28］，攜帶2個突變的患者有更重的表型［4，29］，含有深部內含子突變的患者有相對更重的表型［28］。我們首次鑒定了復合雜合子變異體（c.1084G>A，p.G362S 和c.1850A>G，p.Q617R）。患者的母親是一個變異（c.1084G>A）的攜帶者，而他的父親是另一個變異的攜帶者（c.1850A>G）。然而，患者是家系中唯一表現出明顯臨床表現和患有Gitelman 綜合征的成員。此類病例以前曾有報道［21，30］。在這些研究中，先證者攜帶復合雜合子變異體，其中一個變異體遺傳自母親，另一個遺傳自父親。然而，他們的父母都很健康。而該患者有正常血鎂和高尿酸血癥，是否提示新的突變位點與此有關呢？JIANG 等［4］的研究顯示：7 例正常血鎂患者攜帶13 個突變等位基因，其中12 個為胞內域突變，1 個為跨膜域突變，無胞外域突變；而25 例低鎂血癥患者有46 個突變等位基因，其中26 個位于胞內域，15 個位于跨膜域，5 個位于胞外域；結果提示正常血鎂患者胞內域突變百分比明顯高于低鎂血癥患者。本例患者SLC12A3基因的2 個突變位點編碼的相應NCCT 氨基酸一個位于胞內域，一個位于跨膜域，與以往研究一致。然而，此新的突變位點與正常血鎂及高尿酸血癥的關系還需要進一步的體內外功能學研究來進一步證實和揭示。