煙酰胺單核苷酸對衰老小鼠代謝的干預作用

黨國棟，洪新宇，蔡美琴#

1.上海交通大學公共衛生學院，上海 200025；2.上海市疾病預防控制中心，上海 200051

當前人口老齡化趨勢日益突出，延緩衰老研究已成為生物醫學研究的重要組成部分。衰老過程的特征是機體功能完整性的漸進喪失，伴隨著代謝功能障礙、DNA 不穩定、慢性炎癥、機體損傷等生理變化［1］。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）是在營養攝入和細胞損傷等環境變化中控制細胞功能和存活的關鍵信號分子，NAD+水平隨年齡增長而逐漸下降，導致細胞和器官功能下降、代謝改變和疾病易感性增加［2］。延緩甚至逆轉NAD+水平下降趨勢，可改善肌肉功能、運動能力和心臟功能等衰老相關生理代謝參數［3］。

煙酰胺單核苷酸（nicotinamide mononucleotide，NMN）作為NAD+的前體，是目前直接有效的NAD+補充物質［4］。已有研究證實，NMN 可以改善衰老的血管內皮細胞增殖和遷移受損［5］，促進衰老間質干細胞成骨增殖，減少脂肪生成［6］，提高衰老卵母細胞的受精能力，恢復線粒體功能，抑制活性氧誘導的衰老卵母細胞凋亡［7］，改善衰老引起的血管功能障礙［8］以及腎臟損傷［9］。同時NMN 能糾正炎癥誘導的胰島功能障礙［10］，改變糖尿病模型小鼠的脂質譜［11］，改善脂代謝［12］，促進肥胖人群中肌肉胰島素信號轉導和重塑［13］。這些研究結果提示NMN對代謝功能障礙的潛在治療作用。然而關于NMN 對衰老動物的代謝影響，目前鮮有研究涉及。

本研究擬通過D-半乳糖（D-galactose，D-gal）衰老造模法，建立小鼠衰老模型，從能量代謝、糖耐量、胰島素敏感性、抗氧化應激能力等方面探索NMN 對衰老小鼠代謝的影響并初步探討其可能的作用機制，為NMN的實際應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康3 月齡C57BL/6N 雄性小鼠，無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級，體質量（27±2）g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司。動物生產許可證號SCXK （浙） 2019-0001，使用許可證號SYXK（滬）2018-0031。動物飼養在上海市疾病預防控制中心屏障動物房內，單籠常規飼料喂養，記錄飲食量和飲水量。動物照明模擬自然光照，12 h晝夜更替。本研究于2021年2月份通過上海市疾病預防控制中心實驗動物倫理審查委員會的審查，所有研究操作均遵守《醫學實驗動物管理實施細則》的要求。

1.2 試劑和儀器

NMN（純度99.9%，健安喜公司，中國），D-gal（純度≥99.0%，Sigma公司，美國），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒（南京建成生物工程研究所，中國），BCA 蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術研究所，中國），生物合成人胰島素注射液（Novo Nordisk公司，丹麥）；血糖儀、血糖試紙（OneTouch公司，美國），Denley Dragon Wellscan MK 3 酶標儀（Thermo公司，美國），CLAMS 實驗動物能量代謝監測系統（Columbus公司，美國）。

1.3 衰老模型的建立、分組及干預措施

運用隨機數字表，將實驗動物分為5組：對照組、早衰模型組、衰老模型組、NMN 干預Ⅰ組、NMN干預Ⅱ組。每組14 只小鼠。每組實驗動物處理如下：①對照組。頸背部皮下注射生理鹽水150 mg/kg，灌胃給予300 mg/kg 蒸餾水，每日各1 次，持續6 周。②早衰模型組。頸背部皮下注射D-gal 150 mg/kg，灌胃給予300 mg/kg 蒸餾水，每日各1 次，持續6 周。③NMN 干預Ⅰ組。頸背部皮下注射D-gal 150 mg/kg，灌胃給予300 mg/kg的NMN，每日各1次，持續6周。④衰老模型組。頸背部皮下注射D-gal 150 mg/kg，灌胃給予300 mg/kg 蒸餾水，每日各1 次，持續12 周。⑤NMN 干預Ⅱ組。頸背部皮下注射D-gal 150 mg/kg，灌胃給予300 mg/kg 的NMN，每日各1 次，持續12 周。每日同一時間段記錄飲水量、攝食量，每周稱體質量2 次，每周觀察和記錄小鼠皮毛狀態、行為表現等。

1.4 檢測方法

對照組、早衰模型組、干預Ⅰ組在造模6 周后，檢測臟器指數、能量代謝監測指標、糖耐量、胰島素敏感性以及抗氧化指標。衰老模型組、干預Ⅱ組在造模12周后檢測上述指標。

1.4.1 臟器指數檢測 取出小鼠胸腺、脾臟、肝臟、雙側腎臟，稱取臟器質量，計算胸腺指數、脾臟指數、肝臟指數、腎臟指數。各臟器指數=臟器質量（mg）/體質量（g）。

1.4.2 能量代謝實驗 采用代謝籠，使用CLAMS實驗動物能量代謝綜合監測系統進行評估。小鼠適應代謝籠12 h后，開始實驗。記錄動物72 h內氧氣消耗量（O2consumption，VO2）、二氧化碳呼出量（CO2exhalation，VCO2）；利用紅外光電池技術監測動物的活動量（紅外光束每被打斷1 次，則計數動物活動1 次）。通過評估代謝過程中的氧氣-二氧化碳交換量來計算能量消耗（energy expenditure，EE），根據VO2和VCO2計算實驗動物所用食物的能量含量，即呼吸商（respiratory exchange ratio，RER）。

1.4.3 葡萄糖耐量實驗 小鼠禁食14 h 后，腹腔內注射10%葡萄糖（1 g/kg）。小鼠尾靜脈采血，分別于0、15、30、60、90 和120 min 測定小鼠血糖水平，并計算血糖曲線下面積（area under the curve，AUC）。

1.4.4 胰島素耐量實驗 葡萄糖耐量實驗結束間隔1 d 后，對小鼠進行胰島素耐量實驗。小鼠禁食4 h后，注射生物合成人胰島素注射液（0.75 U/kg）。小鼠尾靜脈采血，分別在0、15、30、60、90 和120 min測定小鼠血糖水平，并計算血糖AUC。

1.4.5 血清及肝組織中抗氧化指標檢測 各組小鼠于末次給予NMN 和生理鹽水，禁食12 h 后，眼眶取血，分離血清。之后脫頸椎法處死小鼠，迅速取出肝臟，制備10%的肝組織勻漿，2 327×g離心10 min，取上清液，置于-80 ℃下保存備用。用酶標儀分別測定小鼠血清及肝組織勻漿超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px） 活 性 及 丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）含量。測試步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.5 統計學分析

采用SPSS 22.0 軟件對數據進行統計分析。定量數據以±s表示。選取單因素方差分析方法比較5 組之間體質量、攝食量、能量代謝監測指標、臟器指數、抗氧化指標的差異；選取兩變量多因素重復測量方差分析方法比較5 組之間的血糖水平的差異；組間兩兩比較用最小顯著性差異（least-significant difference，LSD） 法。P<0.05 表 示 差 異 有 統 計 學意義。

2 結果

2.1 NMN對衰老小鼠能量代謝的影響

2.1.1 NMN 對各組小鼠體質量及攝食量的影響 實驗第1 周（干預前）各組動物體質量間差異無統計學意義（表1），動物毛色油亮有光澤。造模第4周，早衰模型組和衰老模型組小鼠毛色無光澤，活動量減少；造模第6 周，2 個模型組小鼠毛色逐漸發黃，開始掉毛，行動遲緩；造模第12 周，衰老模型組小鼠夾雜白毛，神態萎靡。僅造模第3 周，干預Ⅰ組體質量較對照組顯著增加（P=0.018），其他各組與對照組間體質量間差異無統計學意義（均P>0.05）（表1）。各組小鼠整個實驗期間攝食量之間的差異無統計學意義（均P>0.05）（表2）。

表1 各組小鼠不同階段體質量變化（g，±s）Tab 1 Body mass of mice at different stages in each group（g，±s）

表1 各組小鼠不同階段體質量變化（g，±s）Tab 1 Body mass of mice at different stages in each group（g，±s）

Note: ①P=0.018,compared with the control group.

Group Control group Premature aging model group Intervention group ⅠAging model group Intervention group Ⅱ9th week 12th week-- --- -1st week 28.07±0.29 28.50±0.45 29.14±0.29 28.50±0.23 28.21±0.38 3rd week 28.50±0.39 28.64±0.37 29.71±0.30①29.21±0.33 29.07±0.35 6th week 28.64±0.40 28.57±0.51 29.79±0.39 29.26±0.38 29.07±0.40 31.93±0.46 31.29±0.41 30.79±0.30 30.29±0.30

表2 各組小鼠不同階段每日攝食量變化（g，±s）Tab 2 Food intake of mice at different stages in each group（g，±s）

表2 各組小鼠不同階段每日攝食量變化（g，±s）Tab 2 Food intake of mice at different stages in each group（g，±s）

Group Control group Premature aging model group Intervention group ⅠAging model group Intervention group Ⅱ9th week 12th week-- --- -1st week 4.94±0.14 4.99±0.18 5.31±0.16 5.50±0.11 5.46±0.16 3rd week 4.91±0.15 4.62±0.23 4.91±0.17 4.84±0.22 4.83±0.15 6th week 3.81±0.10 3.47±0.16 3.78±0.10 3.79±0.12 3.12±0.38 4.80±0.11 4.69±0.15 4.69±0.14 4.41±0.16

2.1.2 能量代謝實驗結果 給藥結束后，將小鼠放進代謝籠，按照要求在適應期結束后開始連續觀察72 h。代謝籠實驗結果如圖1所示。

各組之間白天VO2與VCO2水平差異無統計學意義，僅早衰模型組白天VO2水平較對照組降低（P=0.010）。與對照組相比，早衰模型組與衰老模型組夜晚VO2和VCO2水平均顯著下降（VO2：P=0.018，P=0.000。VCO2：P=0.044，P=0.003）；相比衰老模型組，干預Ⅱ組夜晚VO2和VCO2升高顯著（P=0.045，P=0.030）（圖1A、B）。

與對照組相比，衰老模型組和干預Ⅱ組白天和夜晚RER水平升高顯著（白天：P=0.000，P=0.002。夜晚：均P=0.000）；相比各模型組，干預組的RER 水平的差異沒有統計學意義（P>0.05）（圖1C）。

白天小鼠活動量，各組之間差異無統計學意義。夜晚小鼠活動量，相比于對照組，早衰模型組、衰老模型組與干預Ⅱ組均顯著減少（均P=0.000）；與早衰模型組相比，干預Ⅰ組活動量顯著增大（P=0.022）；與衰老模型組相比，干預Ⅱ組活動量顯著增大（P=0.049）（圖1D）。

各組EE 檢測結果與活動量分析結果相符合。夜晚EE 水平，與對照組相比，早衰模型組和衰老模型組降低明顯（P=0.010，P=0.001）。與衰老模型組相比， 干預Ⅱ組EE 水平升高顯著（P=0.043）（圖1E）。

圖1 小鼠代謝籠實驗結果Fig 1 Results of metabolic cage experiment in mice

2.2 NMN對衰老小鼠臟器指數的影響

小鼠臟器指數結果（表3）顯示，相比于對照組，早衰模型組胸腺指數和腎臟指數顯著降低（P=0.035，P=0.009），衰老模型組胸腺指數、脾臟指數、肝臟指數、腎臟指數均顯著降低（P=0.000，P=0.012，P=0.000，P=0.002）。相比于衰老模型組，干預Ⅱ組的肝臟指數顯著提高（P=0.000）。

表3 各組小鼠臟器指數比較（±s）Tab 3 Comparison of the organ indexes in each group（±s）

表3 各組小鼠臟器指數比較（±s）Tab 3 Comparison of the organ indexes in each group（±s）

Note: ①P=0.035, ②P=0.000, ③P=0.012, ④P=0.006, ⑤P=0.009, ⑥P=0.002,compared with the control group; ⑦P=0.000,compared with the aging model group.

Kidney index 14.66±0.37 13.37±0.27⑤14.29±0.50 13.10±0.25⑥13.16±0.03⑥Group Control group Premature aging model group Intervention group ⅠAging model group Intervention group Ⅱn 8 8 8 8 8 Thymus index 2.17±0.07 1.89±0.12①2.04±0.12 1.44±0.08②1.36±0.05②Spleen index 2.20±0.11 2.14±0.11 2.03±0.09 1.81±0.11③1.81±0.10③Liver index 43.10±0.73 43.66±0.36 45.69±0.63④37.80±0.64②41.70±0.71⑦

2.3 NMN對衰老小鼠糖耐量的影響

葡萄糖耐量實驗結果（圖2A）表明，造模6 周時對照組、早衰模型組、干預Ⅰ組小鼠在不同時間點血糖水平差異均無統計學意義。在造模12 周時，相比于對照組，衰老模型組血糖水平明顯升高，干預Ⅱ組血糖水平相比衰老模型組有所降低，與對照組相比略有升高，3 組血糖水平差異具有統計學意義（P=0.000）。其中在60 min 時間點，衰老模型組血糖水平較對照組顯著升高（P=0.000），干預Ⅱ組相比衰老模型組顯著降低（P=0.020）。AUC 分析結果（圖2B）顯示，衰老模型組和干預Ⅱ組出現糖耐量受損（P=0.020，P=0.030），表明隨著造模時間的延長，衰老加劇，導致小鼠的糖耐量受損；干預Ⅱ組AUC 相比于衰老模型組減少了13%（P=0.030），表明糖耐量受損得到改善。

圖2 葡萄糖耐量實驗結果Fig 2 Results of glucose tolerance test

2.4 NMN對衰老小鼠胰島素敏感性的影響

胰島素耐量實驗結果（圖3A）表明，在比較相對于0 時間點血糖水平百分比的變化時，發現對照組、衰老模型組和干預Ⅱ組3 組之間血糖水平差異有統計學意義（P=0.000）。其中在30 min 和120 min 時間點，衰老模型組血糖水平相比對照組明顯升高（均P=0.001），干預Ⅱ組相比衰老模型組顯著降低（P=0.046，P=0.025）。同時AUC 的分析結果（圖3B）也表明，D-gal 衰老造模導致早衰模型組、衰老模型組和干預Ⅱ組小鼠，胰島素敏感性降低（P=0.012，P=0.011，P=0.014）；干預Ⅱ組相比衰老模型組，胰島素敏感性提高（P=0.010）。

圖3 胰島素耐量實驗結果Fig 3 Results of insulin tolerance test

2.5 NMN對衰老小鼠抗氧化水平的影響

2.5.1 各組小鼠血清SOD、GSH-Px 活性及MDA 含量的比較 小鼠血清抗氧化指標檢測結果（表4）顯示：與對照組相比，早衰模型組和衰老模型組的血清SOD、GSH-Px 活性顯著降低（SOD：P=0.002，P=0.001。GSH-Px：P=0.001，P=0.011），MDA 含量顯著升高（均P=0.000），說明模型組小鼠抗氧化水平降低，衰老模型制備成功；與早衰模型組相比，干預Ⅰ組血清SOD、GSH-Px 活性升高明顯（P=0.026，P=0.006），MDA 含量顯著降低（P=0.011）；與衰老模型組相比，干預Ⅱ組SOD 活性升高（P=0.046），MDA含量降低（P=0.000）。

2.5.2 各組小鼠肝組織SOD、GSH-Px 活力及MDA含量的比較 小鼠肝臟抗氧化指標分析結果（表4）顯示：與對照組相比，早衰模型組SOD 活性顯著降低（P=0.032），2 組間MDA 含量、GSH-Px 活性差異無統計學意義；與對照組相比，衰老模型組SOD、GSH-Px 活性顯著降低（P=0.029，P=0.001），MDA含量顯著升高（P=0.002）；與各模型組相比，兩干預組肝組織抗氧化水平均有所改善，但僅干預Ⅱ組的MDA含量的降低具有統計學意義（P=0.000）。

表4 各組小鼠血清及肝組織SOD、GSH-Px活性及MDA含量比較（±s）Tab 4 Effects of NMN on the activities of SOD，GSH-Px and MDA content in serum and liver tissue of each group（±s）

表4 各組小鼠血清及肝組織SOD、GSH-Px活性及MDA含量比較（±s）Tab 4 Effects of NMN on the activities of SOD，GSH-Px and MDA content in serum and liver tissue of each group（±s）

Note: ①P=0.002, ②P=0.001, ③P=0.000 ,④P=0.032, ⑤P=0.011, ⑥P=0.029, compared with the control group; ⑦P=0.026, ⑧P=0.006, ⑨P=0.011, compared with the premature aging model group; ⑩P=0.046, ?P=0.000,compared with the aging model group.

Serum Liver tissue Group n MDA/（nmol·mL-1）0.74±0.03 0.85±0.03 0.77±0.04 0.94±0.07①0.70±0.04?Control group Premature aging model group Intervention group ⅠAging model group Intervention group Ⅱ14 14 14 14 14 SOD/（U·mL-1）140.60±2.96 128.67±2.03①136.94±3.41⑦126.95±2.51②133.91±1.88⑩GSH-Px/（U·mL-1）743.05±38.44 626.22±12.24②714.85±31.53⑧656.65±7.65⑤696.88±11.23 MDA/（nmol·mL-1）5.38±0.19 6.93±0.22③6.12±0.24⑨7.21±0.16③6.36±0.12?SOD/（U·mL-1）169.20±4.99 158.94±2.49④163.17±3.32 158.71±1.45⑥166.83±2.91 GSH-Px/（U·mL-1）505.60±11.58 484.13±21.50 498.91±7.12 587.65±21.14②628.14±18.25③

3 討論

本研究采用D-gal 亞急性衰老模型。在一定時間內連續注射D-gal，可導致細胞代謝紊亂和功能障礙，引起機體衰老［14］。D-gal誘發的衰老使得小鼠在學習記憶能力、行動能力和心臟功能方面呈逐步下降趨勢，與自然衰老過程相似［15］。研究設計了連續給藥6周以及連續給藥12周2個階段，試圖通過延長造模時間，加劇小鼠衰老程度［16］，并通過延長干預時間來觀察長期補充NMN 的效果。目前，動物實驗中有限的NMN抗衰老研究均采用自然衰老模型［17］，聚焦于NMN 的短期干預結果［18］，同時在干預結束的短時間內，存在治療效果消退的情況［19］。本研究采用人工衰老模型小鼠，模擬衰老過程中補充NMN 的預防效果，比較了NMN 對不同衰老程度小鼠的干預結果，結果提示長時間的NMN干預效果更加顯著。

衰老研究中常用代謝組學技術［20］，通過對生物體內源性代謝物的分析來反映機體的代謝表型和生理變化［21］。不同于代謝組學技術，本研究利用間接測熱法這一測定能量代謝的黃金標準［22］，通過CLAMS實驗動物能量代謝綜合監測系統得到小鼠呼吸代謝量、活動量、EE 等代謝指標，其可直觀反映小鼠能量代謝水平。結果發現，各組小鼠在白天時大部分能量代謝水平指標之間的差異無統計學意義。NMN 干預對衰老小鼠的能量代謝水平影響主要表現在夜晚小鼠活躍活動期間，其潛在機制可能與NAD+生物合成的晝夜節律性變化相關［23］。UDDIN 等［24］研究已證實，NMN 能夠增加肌肉和肝臟組織中的NAD+水平，降低肥胖小鼠的三酰甘油含量，升高檸檬酸合酶活性，促進脂肪分解代謝。本研究發現，延長NMN 的干預時間，可明顯提高衰老小鼠能量代謝水平，其機制可能與NMN可能提高小鼠的脂質利用率有關。

隨著年齡的增長，肝臟中的NAD+水平降低，衰老過程中更容易出現葡萄糖不耐受和胰島素抵抗［25］。本研究發現，造模6 周時小鼠血糖水平干預組與模型組之間差異無統計學意義。隨著造模及干預時間的延長，造模12 周時模型組小鼠，衰老程度加劇，糖耐量受損加重，胰島素敏感性降低，而干預組小鼠的糖耐量受損較輕、胰島素敏感性較模型組有所改善。YOSHINO 等［11］研究證實，NMN 可改善高脂飲食誘導的2 型糖尿病小鼠的葡萄糖不耐受性。而關于NMN 對糖尿病前期的血糖受損干預效果，目前鮮有研究。本研究證實了NMN 可以有效干預衰老小鼠的血糖調節功能，改善其糖耐量和胰島素敏感性。

氧化損傷發生在衰老的過程中，抗氧化酶SOD和GSH-Px 對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用［26］。機體內脂代謝過程中的MDA可間接反映脂質過氧化程度，是評價氧化應激水平的重要指標［27］。本研究結果發現，衰老小鼠氧化應激水平增高，抗氧化水平降低，造成氧化損傷；給予NMN 干預可部分提高小鼠血清和肝組織中的抗氧化水平，改善衰老造成的氧化損傷。研究［28］表明，依賴于NAD+的去乙酰化酶沉默信息調節因子1 （silent information regulator 1，SIRT1）在代謝和氧化應激中起著重要作用，其活性的增加可提高機體的抗氧化能力。NAD+水平的高低影響SIRT1 的活性，提高細胞內NAD+水平可有效激活SIRT1 和線粒體代謝［29］。NMN 作為NAD+生物合成的中間產物，其干預作用是否是通過增加NAD+水平、激活SIRT1 及其相關通路、提高機體的抗氧化能力、改善氧化應激，從而促進代謝活力、提升代謝水平，還需要進一步深入研究探討。

綜上所述，本研究證實給予衰老小鼠一定劑量的NMN，連續進行6周及12周的干預，其在能量代謝、糖耐量、胰島素敏感性等方面有一定的改善，表明NMN 能一定程度改善衰老小鼠代謝水平。其作用機制可能與提高機體的抗氧化能力有關。同時本研究比較了NMN 對不同衰老程度小鼠的干預效果，發現NMN 干預時間越長，對衰老小鼠代謝能力的改善愈發顯著。對于NMN 改善衰老小鼠代謝的機制，后續尚需通過檢測相關蛋白通路等方式進行進一步研究。

致謝 本次實驗所用的NMN純品原料由GNC健安喜提供，特此感謝。