原鈣黏附蛋白7 在脂多糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞焦亡中的作用

王艷玲 譚芳 游意瑩 余小芳 黃菲

膿毒性急性腎損傷（SAKI）是一種重癥患者術(shù)后常見且嚴(yán)重影響預(yù)后的并發(fā)癥，發(fā)生率高達(dá)50%，是導(dǎo)致患者發(fā)展為慢性腎病甚至死亡的關(guān)鍵原因。前期研究已報道SAKI 主要發(fā)生在腎小管上皮細(xì)胞，且細(xì)胞焦亡是SAKI 發(fā)生發(fā)展過程中的重要事件，通過抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞死亡可明顯減輕SAKI，然而其機(jī)制尚未完全闡明。

研究表明，細(xì)菌等傷害性信號刺激使caspase-1活化，活化的caspase-1 一方面切割Gasdermin D誘導(dǎo)細(xì)胞膜穿孔和破裂引起細(xì)胞死亡。另一方面促進(jìn)IL-1β 和IL-18 活化和釋放，引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡，而過度的細(xì)胞焦亡會因細(xì)胞死亡和級聯(lián)炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致器官損傷和疾病的發(fā)生。原鈣黏附蛋白7（PCDH7）是鈣黏蛋白超家族的一組跨膜糖蛋白，廣泛參與細(xì)胞識別、通信、運(yùn)動等細(xì)胞活動，介導(dǎo)生長分化、炎癥、免疫應(yīng)答及腫瘤轉(zhuǎn)移等復(fù)雜生物學(xué)過程。有研究顯示PCDH 可通過干預(yù)炎癥因子、趨化因子等的募集和浸潤，控制級聯(lián)炎癥反應(yīng)，參與疾病的防治。本研究擬評價脂多糖（LPS）刺激引起腎小管上皮細(xì)胞PCDH7 表達(dá)和細(xì)胞焦亡過程的變化。

材料與方法

一、材 料

腎小管上皮細(xì)胞株（HK-2）購自美國ATCC 公司，SYBR Green RT-PCR 試劑盒購自日本TOYOBO，BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自美國Thermo Scientific 公司， PCDH7、NLR 家族Pyrin 域蛋白3（NLRP3）、caspase-1 和IL-1β 抗體購自美國Santa Cruz 公司，MTT 試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、TNF-α 和IL-1β 含量測定試劑盒均購自廣州杰特偉生物科技有限公司，原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）試劑盒購自美國 Roche 公司。

二、方 法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)

配制含10%胎牛血清的DMEM/F12 完全培養(yǎng)基，將HK-2 復(fù)蘇后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，加入7 mL培養(yǎng)基，并置于37℃、5%CO培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。待細(xì)胞生長達(dá)到80%融合時，用0.05%胰蛋白酶消化并傳代，每4～5 d 傳代1 次，選取處于對數(shù)生長期并且狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

2. 實驗分組與處理

HK-2 以1.5×10個/mL 的密度接種于96 孔培養(yǎng)板，研究分為Control 組和LPS 組。Control 組置于常氧恒溫培養(yǎng)箱（37℃，5%CO-21%O-74%N）中培養(yǎng)24 h；LPS 組加入含2 μg/mL LPS（Sigma公司， 美國）的培養(yǎng)基，置于常氧恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h；每組設(shè)置復(fù)孔5 個。

3. 檢測方法

MTT 法檢測細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞焦亡率，ELISA 法檢測細(xì)胞分泌TNF-α 和IL-6 的水平，全自動生化分析儀檢測LDH 含量，分別參照產(chǎn)品說明書完成檢測。

4. 蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達(dá)

根據(jù)總蛋白提取裂解液說明書按步驟操作，取適量蛋白樣本進(jìn)行電泳，分離后轉(zhuǎn)膜、封閉。洗膜后加入一抗4℃孵育過夜，再加入二抗（1∶5000） 室溫下孵育1 h。洗膜3 次后顯色曝光。采用Tanon-4500 凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析。

5. RT-PCR 法檢測mRNA 表達(dá)

按照RNA 快速提取試劑盒說明書提取各組細(xì)胞中的RNA，測定RNA 純度與濃度，逆轉(zhuǎn)錄后測定目的基因，選擇β-actin 作為內(nèi)參基因。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件和GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析及作圖，使用Kolmogorov-Smirnov檢驗數(shù)據(jù)的正態(tài)性，Levene 檢驗用于檢驗方差齊性。正態(tài)分布的計量資料以 表示，2 組間比較采用獨立樣本t 檢驗。P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、LPS 刺激對腎小管上皮細(xì)胞生存率和焦亡率的影響

與Control 組比較，LPS 組明顯降低腎小管上皮細(xì)胞的生存率（P ＜ 0.001），增加腎小管上皮細(xì)胞的焦亡率（P ＜ 0.05），見表1。

表1 LPS 組與Control 組腎小管上皮細(xì)胞生存率、焦亡率比較（±s，n = 5） 單位：%

二、LPS 刺激對腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子和LDH 水平的影響

與Control 組比較，LPS 組炎癥因子TNF-α和IL-6 水平明顯升高（t= -24.381，P ＜ 0.001；t= -15.205，P ＜ 0.001），細(xì)胞損傷指標(biāo)LDH 水平也明顯升高（t= -8.771，P ＜ 0.001），見圖1。

圖1 2 組細(xì)胞炎癥因子和LDH 水平變化

三、LPS 刺激對腎小管上皮細(xì)胞PCDH7 表達(dá)的影響

與Control 組比較，LPS 組PCDH7 表達(dá)明顯下調(diào)，見圖2。

圖2 2 組腎小管上皮細(xì)胞PCDH7 蛋白表達(dá)的比較

四、LPS 刺激對腎小管上皮細(xì)胞PCDH7 蛋白表達(dá)的影響

蛋白免疫印跡法灰度分析結(jié)果顯示，LPS 組細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、caspase-1 及IL-1β表達(dá)均高于Control 組（t= -7.359，P = 0.009；t= -22.390，P = 0.001；t= -8.717，P =0.006），見圖3。

圖3 2 組細(xì)胞細(xì)胞焦亡蛋白表達(dá)的比較

五、LPS 刺激對腎小管上皮細(xì)胞PCDH7、NLRP3、caspase-1 和IL-1β mRNA 表達(dá)的影響

與Control 組比較，LPS 組PCDH7 mRNA 的表達(dá)下調(diào)，NLRP3、caspase-1 和IL-1β mRNA 的表達(dá)上調(diào)，見表2。

表2 2 組腎小管上皮細(xì)胞PCDH7、NLRP3、caspase-1、及IL-1β mRNA 表達(dá)的比較（±s，n = 5）

討 論

重癥患者常由于感染或腸黏膜屏障破壞、腸道菌群改變和微生物易位，引起全身性炎癥反應(yīng)，改變宿主的免疫和代謝穩(wěn)態(tài)，引起膿毒血癥，并驅(qū)動術(shù)后急性腎損傷（AKI）的發(fā)生，而AKI 期間炎癥介質(zhì)和代謝產(chǎn)物的清除減少，進(jìn)一步導(dǎo)致腸道損傷和黏膜屏障破壞，加重SAKI，導(dǎo)致惡性循環(huán)從而造成嚴(yán)重后果。膿毒血癥患者圍術(shù)期病理生理變化非常復(fù)雜，術(shù)后AKI 的高發(fā)生率是影響患者預(yù)后和導(dǎo)致患者死亡的重要原因之一。

SAKI 同心源性、缺血再灌注等原因引起AKI明顯不同的病理學(xué)表現(xiàn)，主要表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞凋亡和炎性細(xì)胞浸潤，而在其他原因AKI中常見的細(xì)胞壞死幾乎不存在。有證據(jù)表明，SAKI 的起源是多方面的，存在幾種并發(fā)機(jī)制，其中特有的募集和誘導(dǎo)炎癥因子、趨化因子、其他黏附分子等的浸潤，級聯(lián)放大炎癥反應(yīng)在誘導(dǎo)最早期的細(xì)胞損傷尤為重要。組織修復(fù)與細(xì)胞死亡相關(guān)基因PCDH7 具有促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動優(yōu)于維持細(xì)胞黏附穩(wěn)定性的特點，介導(dǎo)動態(tài)細(xì)胞過程。多項研究顯示PCDH 可通過調(diào)控炎癥因子和趨化因子等的募集和浸潤，參與多種疾病的防治。本研究基于上述研究背景，發(fā)現(xiàn)LPS 刺激腎小管上皮細(xì)胞引起細(xì)胞焦亡，伴隨PCDH7 的表達(dá)抑制，提示PCDH7 的表達(dá)減少可能參與LPS 引起的腎小管上皮細(xì)胞焦亡過程。

本研究使用LPS 刺激腎小管上皮細(xì)胞建立腎小管上皮細(xì)胞損傷模型，基于前期研究和預(yù)實驗結(jié)果，選取濃度為2μg/mL 的LPS 刺激腎小管上皮細(xì)胞，結(jié)果表明LPS 引起以細(xì)胞焦亡損傷形式為主的腎小管上皮細(xì)胞損傷過程，表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞生存率下降，細(xì)胞焦亡率升高，炎癥因子IL-6 和TNF-α、細(xì)胞損傷指標(biāo)LDH 水平明顯升高，細(xì)胞焦亡指標(biāo)NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白及mRNA 水平升高，此研究結(jié)果與同行相關(guān)研究結(jié)果一致。在此基礎(chǔ)上，為了確定 PCDH7是否參與LPS 誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞焦亡過程，本研究進(jìn)一步觀察組織修復(fù)和細(xì)胞死亡相關(guān)基因PCDH7 的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS 刺激腎小管上皮細(xì)胞損傷過程伴隨PCDH7 蛋白和mRNA 的表達(dá)明顯下調(diào)，提示PCDH7 的表達(dá)減少參與LPS 引起腎小管上皮細(xì)胞焦亡過程。研究報道了內(nèi)皮細(xì)胞中的“組織修復(fù)相關(guān)基因”PCDH 可通過細(xì)胞骨架動力學(xué)調(diào)控，在多種損傷修復(fù)過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞極性遷移的作用。研究已證實PCDH1是氣道功能的重要物理屏障，吸煙明顯降低肺組織PCDH1 的表達(dá)，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞增多和氣道高反應(yīng)性。PCDH17 前體在潰瘍性結(jié)腸炎的受損黏膜中高表達(dá)，參與創(chuàng)傷早期朝向創(chuàng)傷位點的細(xì)胞極化遷移。因此，我們認(rèn)為 LPS 可能通過調(diào)控腎小管上皮細(xì)胞PCDH7 的表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞焦亡損傷過程。

DNA 甲基化是一種介導(dǎo)多種疾病發(fā)生過程的表觀遺傳修飾。研究揭示了PCDHB 基因甲基化在膿毒性炎癥反應(yīng)過程中調(diào)節(jié)白細(xì)胞的黏附和遷移功能，影響膿毒癥的嚴(yán)重程度并導(dǎo)致不良預(yù)后。受損腎臟組織即使在起始的AKI 完全恢復(fù)以后，部分AKI 仍會向慢性腎臟病轉(zhuǎn)變，這種被稱為“損傷記憶”的現(xiàn)象就是由表觀遺傳學(xué)的改變介導(dǎo)，肯定了以表觀遺傳學(xué)手段為靶向防治腎損傷的可行性。未來我們將進(jìn)一步從PCDH7 甲基化的角度深入探究其參與LPS 引起腎小管上皮細(xì)胞焦亡的分子機(jī)制，進(jìn)而從表觀遺傳學(xué)角度為重癥患者術(shù)后SAKI 的精準(zhǔn)防治提供新思路。

綜上所述，LPS 刺激腎小管上皮細(xì)胞損傷的細(xì)胞焦亡過程與其對PCDH7 表達(dá)的調(diào)控有關(guān)。