Toll 樣受體9 在呼吸系統疾病中的作用機制研究進展

燕江雪 曹囡囡 丁霞 倪倩

Toll 樣受體（TLR）是一類模式識別受體，與配體結合后，啟動胞內免疫信號蛋白的級聯反應、激活免疫應答信號通路，在激活宿主天然免疫和適應性免疫反應、增強免疫防御的過程中發揮關鍵作用。人類TLR 共包含10 個功能性受體（TLR1～TLR10），TLR9 可在識別配體未甲基化的CpG 二核苷酸后，啟動下游免疫信號通路，激活免疫反應，從而在呼吸系統疾病中發揮重要作用。本文就TLR9 在呼吸系統常見疾病中的作用及其機制進行綜述。

一、TLR9

1. TLR9 在細胞內的運輸途徑及信號通路

TLR9 位于靜息細胞的內質網，需要內體穿梭以啟動信號轉導。不協調的93 同系物B1（UNC93B1）是內質網駐留蛋白，可調控TLR9 包裝為外殼蛋白復合物Ⅱ（COP Ⅱ）囊泡，從而使TLR9 轉運至高爾基體。靜息狀態下，TLR9 與UNC93B1 共同定位于內質網，TLR9 通過COP Ⅱ囊泡，沿分泌途徑到達高爾基體、質膜；而TLR9可與質膜上的激活蛋白2（AP-2）以網格蛋白依賴的方式內吞進入內體溶酶體系統，在內體酸化后，組織蛋白酶和肽鏈內切酶水解TLR9。同時，TLR9的配體CpG 也以網格蛋白依賴的方式內吞后進入內體溶酶體系統。當TLR9 及其配體進入內體溶酶體系統后，啟動信號轉導。

TLR9 信號轉導通路募集的參與分子取決于細胞類型。在巨噬細胞、漿細胞樣樹突狀細胞（pDC）和經典DC 中，活化的TLR9 通過募集髓樣分化因子88（MyD88），激活IL-1 受體相關激酶4（IRAK 4）、IRAK1 和IRAK2 等信號分子，繼而激活核因子-κB（NF-κB）的信號通路，合成促炎細胞因子，如TNF-α、IL-6 和IL-12 等。但在pDC上，TLR9 主要啟動Ⅰ型IFN（IFN-Ⅰ）合成途徑，MyD88 通過引導IFN 調節因子7（IRF7）向細胞核易位，進而促進細胞合成IFN-I。

2. TLR9 的配體

未甲基化的CpG 二核苷酸是TLR9 的配體，存在于天然的細菌、病毒及線粒體的DNA 中。未甲基化的CpG 二核苷酸激活TLR9 及下游信號，可誘導強烈的1 型輔助性T 淋巴細胞（Th1）為主的免疫反應。Th1產生細胞因子如IFN-γ、 IL-12等，繼續活化自然殺傷（NK）細胞、增強CD8T 淋巴細胞的免疫應答。同時，這一級聯免疫反應可抑制Th2 介導的免疫反應，減少細胞因子如IL-4、IL-5 等的生成。CpG 寡脫氧核苷酸（CpG ODN）是人工合成的含有非甲基化CpG 的ODN，有學者發現CpG ODN 可通過TLR9/MyD88 信號通路促進IL-10 等產生，從而抑制過敏性氣道炎癥反應。因此，TLR9 的配體可作為變應性哮喘中病理性Th2免疫應答反應的調節劑。另外，CpG ODN 聯合免疫靶點阻斷療法已用于腫瘤免疫治療的研究。

二、TLR9 與呼吸系統疾病

研究表明，TLR9 與多種呼吸系統疾病，如哮喘、肺癌和肺炎等疾病發生發展有密切關聯，并影響疾病的轉歸與預后。

1. TLR9 與哮喘

哮喘是慢性氣道免疫炎癥性疾病，其病理機制主要為：Th2 生成的細胞因子（如IL-4、IL-5、IL-9 和IL-13）增多，Th1 生成的細胞因子（IL-2）減少，B淋巴細胞產生的IgE增多，募集肥大細胞、嗜酸性粒細胞等，促進哮喘的氣道炎癥。

TLR9/IL-2 軸通過抑制IL-17A 的過度生成而加重哮喘。IL-2 是Th17 生成IL-17A 的負調控因子。在屋塵螨誘導的過敏性哮喘動物模型中，TLR9 缺失小鼠與野生型（WT）小鼠相比，嗜酸性粒細胞數量減少，氣道高反應性降低；同時Th2 細胞因子IL-4、IL-5 和IL-13 的產生受到抑制，Th1 生成的IL-2 減少，導致Th17 生成的IL-17A 增多，而過量的IL-17A 可抑制過敏性氣道炎癥反應，提示TLR9/IL-2 軸通過抑制IL-17A 的過量產生，從而促進氣道高反應性和氣道炎癥。另外，NaR9 是TLR9 抑制抗體，可以抑制屋塵螨誘導的氣道高反應性和Th2 型炎癥反應；使用NaR9 阻斷TLR9，IL-17A 的生成增多，這與TLR9 缺失小鼠表現類似，結合以上研究結果，證明在屋塵螨誘導的過敏性哮喘中，NaR9 通過抑制TLR9/IL-2 軸，促進IL-17A 的過量生成，從而抑制過敏性哮喘的炎癥反應。

c-Jun 氨基末端激酶（JNK）/TLR9 信號通路通過抑制褪黑素生物合成，介導過敏性氣道炎癥。SP600125 是JNK 的特異性抑制劑，可減輕卵清蛋白（OVA）誘導的WT 小鼠過敏性氣道炎癥。有學者發現，由OVA 誘導構建的過敏性氣道疾病動物模型中，TLR9 和磷酸化JNK 的表達水平明顯升高。TLR9 缺失可有效抑制氣道炎癥，使肺部炎癥細胞的募集和黏液分泌明顯減少，血清中特異性的IgE 表達水平降低，支氣管肺泡灌洗液內的炎癥因子，如IL-4、IL-13 及IFN-γ 表達水平明顯減少。TLR9 缺失對JNK 的磷酸化表達水平沒有影響，但通過SP600125 抑制JNK 后TLR9 的表達水平明顯降低，提示JNK 作為TLR9 信號通路的上游分子，參與誘導過敏性氣道炎癥。褪黑素屬于胺類激素，具有抗炎和免疫調節功能，由色氨酸合成，其合成途徑涉及2 種關鍵酶，分別是N-乙酰基轉移酶和羥基吲哚-氧-甲基轉移酶（HIOMT）。研究表明，哮喘患者的唾液或血清褪黑素表達水平明顯低于健康對照組，外源性和內源性褪黑素均可抑制氣道炎癥。當OVA 刺激小鼠后，肺組織中HIOMT蛋白表達減少，在支氣管肺泡灌洗液和血清中，褪黑素的表達水平降低；但在TLR9 缺失后，這種作用消除。SP600125 升高了OVA 誘導小鼠模型中HIOMT 蛋白表達和褪黑素表達水平，但這種影響在TLR9 缺失后消除。以上結果表明OVA 刺激可激活JNK/TLR9 信號通路，該信號通路可作為負信號調節HIOMT 蛋白的表達和褪黑素的產生，從而誘導過敏性氣道炎癥反應。也有研究報道，MyD88 缺失小鼠在OVA 誘導下產生氣道炎癥，提示OVA 通過激活非MyD88 依賴性的TLR9 信號通路，導致氣道炎癥。

但在多種OVA 誘導的過敏性疾病的動物模型中，CpG ODN 可抑制過敏性氣道炎癥反應，這是由于純化的CpG ODN 可通過TLR9/MyD88 信號通路，促進IL-10 等產生，從而改善氣道炎癥。目前TLR9 作為過敏性氣道疾病新的治療靶點仍存在爭議，因此需要更多的研究進一步探索TLR9 在哮喘等過敏性疾病中的機制。

2. TLR9 與肺癌

肺癌是人體常見腫瘤之一。炎癥是腫瘤的標志性反應之一，在腫瘤微環境中存在的TLR 在識別特異性配體后激活，并誘導宿主產生適應性免疫反應。TLR 就像一把雙刃劍，一方面識別腫瘤特異性抗原并激活天然免疫反應，另一方面通過誘導持續的適應性反應來促進潛伏的慢性炎癥，從而促進腫瘤的發生發展。目前已發現TLR9 在肺癌進展中發揮了重要作用，但其相關機制有待進一步闡明。

有研究者通過體外實驗發現肺腺癌細胞中激活的TLR9 可誘導神經酰胺酶活化，導致1 磷酸鞘氨醇（S1P）形成甚至過表達，從而介導NF-κB通路釋放TNF-α 等，表明TLR9/S1P 軸依賴性的炎癥信號通路通過誘導有利于S1P 的神經酰胺/S1P 的失衡，在炎性呼吸疾病的惡化中發揮重要作用。

程序性死亡受體1（PD-1）及其配體作為靶點的免疫療法，是臨床上針對非小細胞肺癌等惡性腫瘤的一個重要的治療方案。但當抗PD-1 抗體單獨用于治療非小細胞肺癌時，僅對約20%患者有效，這表明需要進一步聯合治療。Perry 等在肺腺癌和肺鱗癌的小鼠原位癌轉移模型中，以非潤濕模板粒子復制技術生產的納米顆粒作為載體，經口氣管滴注，將CpG 遞送到小鼠肺臟中，明顯促進了腫瘤的消退，并限制了與可溶性CpG 相關的全身毒性反應，證明局部CpG 可以協調天然免疫和獲得性免疫反應的活化，加強機體抗腫瘤免疫反應。研究表明，吸入霧化TLR9 激動劑聯合抗PD-1 治療可增強機體免疫細胞對肺內、肺外腫瘤的殺傷作用，這與腫瘤微環境中功能性效應CD8T 淋巴細胞的增多有關。IMO-2055 是一種CpG ODN，屬于TLR9 激動劑，目前已在Ⅰ期和Ⅱ期試驗中證實其可聯合靶向免疫藥物治療肺癌。一項晚期非小細胞肺癌的I 期臨床試驗證明，IMO-2055 與厄洛替尼和貝伐珠單抗聯合治療具有良好的耐受性和抗腫瘤活性。以上研究提示，TLR9能否成為肺癌免疫治療的新靶點仍需進一步的探索研究。

3. TLR9 與肺炎

3.1 TLR9 與非感染性肺炎

TLR9 可加重矽肺小鼠的肺部炎癥和纖維化的程度。在矽肺動物模型中，WT 小鼠暴露于二氧化硅（SiO）顆粒后出現肺部炎癥、形成肉芽腫和纖維化。暴露于SiO顆粒的TLR9 缺失小鼠的肺部炎癥和纖維化程度相對較低，且肺功能得到改善。接觸SiO顆粒會導致線粒體損傷、DNA 釋放和線粒體自噬，釋放的游離線粒體DNA（ mtDNA）可激活TLR9，進而加重肺部炎癥反應。以上證據表明，TLR9 與矽肺的疾病進展密切相關。

游離mtDNA 是線粒體損傷相關分子模式（DAMP）的主要成分，在病理狀態下釋放增加，并參與各種炎癥性疾病的發生發展。游離mtDNA 含有大量未甲基化的CpG 二核苷酸，通過TLR9 激發促炎信號，導致嚴重的炎癥反應。紅細胞內的TLR9 可清除游離mtDNA，從而減輕肺損傷。Hotz 等通過研究發現紅細胞可表達TLR9，DNA 與紅細胞的結合是由TLR9 介導的，紅細胞可從循環中清除CpG-DNA，紅細胞的DNA清除功能缺陷可增強CpG-DNA 介導的肺損傷，表明紅細胞上TLR9 介導的游離mtDNA 清除對減輕肺損傷是必要的。

3.2 TLR9 與感染性肺炎

TLR9 可增強流行性感冒（流感）患者繼發耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）感染的易感性。流感病毒屬于單鏈RNA 病毒。人流感病毒分為甲型、乙型及丙型。流感可引起季節性流行，并可繼發細菌性肺炎，如肺炎鏈球菌肺炎和金黃色葡萄球菌肺炎，增加流感患者的病死率。流感病毒感染可誘導IFN-Ⅰ介導的免疫信號，抑制中性粒細胞的募集及IL-17 的免疫反應，從而導致宿主繼發細菌感染的易感性增加。在流感病毒感染繼發細菌感染后，機體代償性募集中性粒細胞，提高宿主對細菌感染的抵抗力。甲型流感病毒（IAV）感染可增加人單核細胞和DC 中TLR9 的表達水平。與WT 小鼠相比，TLR9 缺失小鼠對IAV 或MRSA感染的易感性未見差異；但在IAV 繼發MRSA 感染后，TLR9 缺失小鼠存活率提高，肺部細菌清除能力增強，而病毒載量未見差異。另外，在IAV繼發肺炎鏈球菌感染后，細菌清除作用沒有改善。以上結果表明，TLR9 可增強流感繼發MRSA 的易感性，但對繼發性肺炎鏈球菌肺炎的易感性無影響［20-21］。

在鮑曼不動桿菌肺炎的小鼠模型中，TLR9 缺失小鼠的肺部細菌負荷明顯增加，肺外細菌播散增多，肺損傷加重，證明TLR9 介導的信號通路對于宿主防御鮑曼不動桿菌具有重要意義。在肺炎克雷伯菌和肺炎鏈球菌感染的動物模型中，TLR9缺失小鼠的病死率升高，細菌負荷增多。與WT 小鼠相比，TLR9 缺失小鼠更易感染隱球菌，且IFN-γ 和IL-17 的生成減少，感染后的肺損傷加重，病死率升高，證明在宿主抵御隱球菌感染的過程中TLR9 發揮了重要作用。以上研究均表明，TLR9 與肺部炎癥的發生發展相關，但TLR9能否作為治療靶點尚不能下定論，還需要更深入的研究探討。

三、結 論

TLR9 在免疫細胞和非免疫細胞的內體膜上均有大量表達，其與配體結合活化后，通過激活天然和適應性免疫系統，在哮喘、肺癌和肺炎等呼吸系統疾病中發揮重要作用。TLR9 的配體有可能是預防及治療呼吸系統上述疾病的潛在治療靶點。目前需要更多的研究來深入了解TLR9 與呼吸系統疾病的相關致病機制，為呼吸系統疾病的治療開拓新思路。