基于HPLC檢測枸杞西洋參軟膠囊中人參皂苷Rb1含量的方法學研究

趙 雨，褚海清，王結鑫，閆昊前，張立明，2，3*

(1.寧夏醫科大學 藥學院，寧夏 銀川 750004；2．寧夏特色中醫藥現代化工程技術研究中心， 寧夏 銀川750004；3．寧夏醫科大學 回醫藥現代化教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750004)

枸杞西洋參軟膠囊是由西洋參和枸杞這兩味藥材經過工藝優化加工制成的一種健康產品，枸杞是一味傳統常用藥食同源中藥材，始載于《神農本草經》，被列為上品，謂之“久服堅筋骨，輕身不老，耐寒暑”[1]。西洋參是五加科草本植物的干燥根[2-3]。

枸杞西洋參軟膠囊是以枸杞和西洋參中提取的枸杞多糖和西洋參皂苷為原料制成的中藥制劑，含有皂苷、多糖、黃酮等多類化合物，其中人參皂苷是西洋參的主要活性成分，而人參皂苷目前已分離出40多種單體，主要有Rb1、Rb2、Re、Rc等[4]，在前期研究的西洋參皂苷提取分離純化過程中，經過70%乙醇大孔樹脂洗脫，高效液相檢測，發現作為西洋參中的主要成分之一的人參皂苷Rb1含量較大。現有研究顯示，人參皂苷Rb1在心血管系統、中樞神經系統、免疫調節等方面的應用非常廣泛，具有增強學習記憶能力、促進神經遞質的釋放、保護心肌細胞等藥效作用[5-7]。現代人由于工作壓力大，生活節奏快，時常出現精力不旺、記憶力下降、易疲勞、睡眠不好等癥狀，因此，人們也越來越重視養生、溫補的重要性。枸杞西洋參軟膠囊中的有效成分對人體有延年益壽、減輕疲勞的作用，能夠緩解熬夜造成的精力不旺等癥狀，滿足養生的需求。

人參皂苷Rb1的測定方法有薄層色譜掃描法(TLCS)和高效液相梯度洗脫法，較薄層色譜掃描法(TLCS)而言，高效液相法(HPLC)分析結果準確可靠、誤差小、重現性良好[8]。本研究采用HPLC首次對枸杞西洋參軟膠囊中人參皂苷Rb1的含量進行精密測定，并對檢測方法進行耐用性評價，采用專屬性、精密度、穩定性、重復性、加樣回收率等來考察評價HPLC測定的科學性，為枸杞西洋參軟膠囊的進一步研究和質量標準的制定提供科學數據，為中藥制劑生產的全程質量監控提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人參皂苷Rb1對照品(批號：Z20S9X70603)；實驗中所用乙腈、磷酸均為色譜純；水為去離子水；其余試劑均為分析純。枸杞提取物、西洋參提取物均為實驗室自制。

1.2 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀(Agilent 1260 VWD檢測器、Agilent 1260 自動化進樣器、agilent 1260 色譜工作站)；分析天平。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液；流速為1 mL/min，檢測波長：203 nm；進樣量：10 μL；柱溫：35 ℃[9]。

1.3.2 溶液制備 (1)對照品溶液的制備：精密稱取人參皂苷Rb1對照品2 mg，置于2 mL的量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

(2)供試品溶液的制備：取枸杞西洋參軟膠囊15粒，傾出內容物，混勻，取約2.5 g，精密稱定，加乙醚25 mL，振蕩混勻，超聲(功率為220 W，頻率為50 kHz)處理0.5 min，10 000 r/min離心5 min，棄去上層乙醚液，濾渣揮干乙醚，沉淀加水飽和的正丁醇50 mL，稱定重量，置水浴中加熱回流1.5 h，放冷，再稱定重量，用水飽和正丁醇補足減失的重量，搖勻，濾過[10]。精密量取續濾液25 mL，置蒸發皿中，蒸干，殘渣加50%甲醇適量使溶解，轉移至10 mL的量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

(3)陰性對照溶液的制備：按處方比例制備缺西洋參皂苷的陰性制劑，再按“1.3.2”項下方法制備陰性對照溶液。

1.4 方法學考察[11]

1.4.1 線性關系考察 精密吸取“1.3.2”項下制備的對照品儲備液，用0.22 μm微孔濾膜濾過，分別吸取上述對照品溶液5、8、10、15、20、25 μL進樣，記錄峰面積和保留時間。以對照品進樣量為橫坐標(X)、峰面積為縱坐標(Y)制作標準曲線。

1.4.2 專屬性實驗 分別吸取“1.3.2”項下的對照品溶液、“1.3.2”項下的供試品溶液和“1.3.2”項下的陰性對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按照色譜條件進樣測定。

1.4.3 精密度實驗 取“1.3.2”項下制備的對照品溶液，連續進樣6次，按照色譜條件進樣測定。

1.4.4 穩定性實驗 取“1.3.2”項下制備的供試品溶液，在第0、6、12、24、48 h進樣，按照色譜條件進樣測定，測定峰面積值。

1.4.5 重復性實驗 精密取枸杞西洋參軟膠囊5份，按照“1.3.2”項下“(2)供試品溶液的制備”方法制備供試品溶液，按照色譜條件進樣測定。

1.4.6 加樣回收率實驗 精密稱取枸杞西洋參軟膠囊，分別按照表添加各對照品，按照“1.3.2”項下“(2)供試品溶液的制備”方法制備供試品溶液，共9份，按照色譜條件進樣測定。

1.5 含量測定

取樣品(批號為20200901、20200902、20200 903)，按“1.3.2”項下“(2)供試品溶液的制備”方法制備供試品溶液，分別按“1.3.1”項下色譜條件進樣測定，計算含量。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 線性關系考察 人參皂苷Rb1標品的線性回歸方程為y=276.89x-35.629(R2=0.999 8，n=6)，結果表明在5～25 μL內，人參皂苷Rb1具有良好的線性關系。見表1、圖1。

表1 人參皂苷Rb1線性關系考察結果

圖1 枸杞西洋參軟膠囊中人參皂苷Rb1標準曲線

2.1.2 專屬性考察 考察結果顯示，陰性對照無干擾，見圖2、圖3、圖4。

圖2 供試品溶液液相色譜

2.1.3 精密度考察 取同一樣品連續進樣6次后，測得人參皂苷Rb1的RSD值為1.52%，表明儀器精密度良好。見表2。

圖3 對照品溶液液相色譜

圖4 陰性對照溶液液相色譜

表2 精密度實驗結果

2.1.4 穩定性考察 在第0、6、12、24、48h進樣，測定峰面積值，結果測得人參皂苷Rb1的RSD值為1.81%，表明供試品在48h內穩定性良好。見表3。

表3 穩定性實驗結果

2.1.5 重復性考察 取同批次的枸杞西洋參軟膠囊5份，按照本研究色譜條件進樣測定，結果人參皂苷Rb1的RSD值為2.64%，表明該方法重復性良好。見表4。

表4 重復性實驗結果

2.1.6 加樣回收率考察 考察結果表明該方法回收率良好。見表5。

表5 加樣回收率實驗結果

2.2 含量測定結果

3批樣品中人參皂苷Rb1含量分別為25.17、25.29、29.18 mg/g。見表6。

表6 3批樣品測定結果

3 討論

本研究選取了以枸杞、西洋參兩味藥食同源藥材制成的延壽抗疲勞保健食品——枸杞西洋參軟膠囊。通過前期枸杞西洋參配伍急性毒性及藥效學實驗，發現枸杞-西洋參配伍參與了機體的免疫調節過程，具有增強免疫、降血脂、常壓耐缺氧和抗疲勞等作用，初步證實其對于睡眠不良、易疲勞、免疫力下降、記憶力減退等人群具有緩解作用。

在此基礎上，本研究以枸杞西洋參配伍制得的軟膠囊為對象，對西洋參中的有效成分人參皂苷Rb1進行了含量測定，以期建立枸杞西洋參軟膠囊的定量測定方法。參照2020版《中華人民共和國藥典》[12]中“采用加熱回流”的方式對西洋參中人參皂苷Rb1進行了提取。本實驗首先制備了枸杞西洋參軟膠囊內容物，用乙醚除去脂溶性成分，經飽和正丁醇加熱回流的處理方法進行樣品處理，采用高效液相色譜柱，當流速1 mL/min、乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫、柱溫35℃時，色譜分離效果較佳，能滿足色譜峰分離度>1.5的要求。

本研究參考大量有關西洋參中人參皂苷含量的測定方法[13-14]，經過多次實驗，并進行方法學驗證。實驗結果顯示，所建立的含量測定方法符合定量要求，且專屬性高，準確性好，方便快捷，可作為枸杞西洋參軟膠囊中人參皂苷Rb1含量測定的方法，并為質量標準的建立提供實驗前提。