銀屑平丸聯合阿維A膠囊對銀屑病樣小鼠模型的療效及IL-17、IL-23的影響

鮑秋羽，席建元

(湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410208)

銀屑病(Psoriasis，PS)是一種由免疫所介導的以紅色斑塊并覆有鱗屑為主要臨床表現的慢性、炎癥性皮膚病[1]。中醫學屬“白疕”范疇。流行病學調查顯示，1990-2017年間，我國銀屑病患病率呈現持續增長的趨勢，至2017年，銀屑病患者人數已達800多萬，較1990年增長了1.95倍[2]。該病除致皮膚癥狀外，還可能出現關節疼痛不利，伴有糖尿病、肥胖以及心腦血管等疾病，嚴重影響著患者的身心健康[3，4]。因此，銀屑病一直是皮膚病研究領域的熱點之一[5]。銀屑病的病理表現為表皮中角質形成細胞的異常增生及分化，伴隨有皮膚血管異常增生以及炎癥細胞的浸潤[6，7]。該病的發病機制與遺傳、免疫、環境、感染等因素相關，但尚未完全明確[8]。有研究表明，銀屑病的發生發展與T細胞、巨噬細胞等及其所分泌的細胞因子之間有復雜的聯系。IL-23在機體免疫中主要發揮著致炎效應，可誘導產生TNF-α，并放大炎癥反應[9]。IL-17可促進Treg細胞分裂增生，可有效抑制Th17細胞的增生分化，達到抑制炎癥反應的目的[10]。因此，對IL-17和IL-23在銀屑病發病進程中產生的機制深入研究，或成為銀屑病治療的突破點。前期研究發現，銀屑平丸治療PS療效顯著，且不良反應少[11]。本實驗擬采用咪喹莫特乳膏制造BALB/c小鼠PS模型，進一步探討銀屑平丸治療PS的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF清潔級雌性BALB/c小鼠40只，體質量18～20 g，8～12周齡，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(許可證號：SCXK(湘)2019-0004)。將小鼠置于中南大學湘雅醫學院動物實驗中心(溫度控制在(21±3) ℃、相對濕度保持在40%～70%飼養，小鼠飼料及可用飲水均由中南大學湘雅醫學院實驗動物中心提供。所有小鼠在實驗前予以5天的適應性喂養，且實驗全程按照動物倫理學標準進行。

1.2 實驗藥物

銀屑平丸為湖南中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑，由我院制劑室提供(批號：20201204，規格：60 g/瓶)；阿維A膠囊(重慶華邦制藥有限公司生產，國藥準字號：H20010126，規格：10 mg)；5%咪喹莫特乳膏(四川明欣有限公司生產，國藥準字號：國藥準字H20030129，規格：3 g：0.15 g，3 g/支)；白凡士林(南昌白云藥業有限公司生產，贛食藥準字：F20050006，規格：500 g)。

1.3 主要試劑與儀器

PBS(美國Hyclone，貨號：80334412)；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)IL-17、IL-23試劑盒(武漢博士德生物，貨號分別為：EK0866、EK1364)；酶標儀：深圳匯松(型號：MB-530)。

1.4 動物分組

通過隨機數字表分組法將40只小鼠分為5組，包括空白對照組、模型組、阿維A膠囊組、銀屑平丸組、阿維A膠囊+銀屑平丸組(中西結合組)，每組8只小鼠。

1.5 PS小鼠模型的建立

實驗前將40只小鼠通過戊巴比妥鈉腹腔注射進行藥物麻醉(80 mg/kg)，隨后使用動物專用剃毛儀給麻醉后實驗小鼠清除背部白毛，充分暴露背部皮膚以外涂藥物造模，面積約3 cm×4 cm大小，其中空白對照組小鼠使用凡士林造模，其他各組小鼠使用5%咪喹莫特乳膏造模，1次/天，連續外用8天。

1.6 動物給藥

依據銀屑平丸臨床藥量標準，每人每日服用藥量為0.75 g/kg，根據人與實驗小鼠體質量比例計算，本研究中用量與臨床等效劑量相當，設定為6.49 g/kg/d。同公式換算可得出阿維A膠囊組的臨床等效量為6 mg/kg/d。使用生理鹽水加熱充分溶解銀屑平丸粉劑及阿維A膠囊粉劑制備實驗所用藥液。外用藥物造模同時，空白對照組以及模型組小鼠灌胃生理鹽水0.4 mL；阿維A膠囊組小鼠灌胃阿維A藥液0.4 mL；銀屑平丸組小鼠灌胃銀屑平丸藥液0.4 mL；每組小鼠每天灌胃1次，連續用藥8天。

1.7 動物取材

實驗第8天24 h后，每只小鼠在眼球處取血1.0 mL，隨即將血液置于4 ℃的低溫下離心1 500轉/min共5 min，并立即抽吸上層血清，置于-20 ℃冰箱保存，用于檢測本次實驗的炎性細胞因子IL-17、IL-23。后續斷頸處死每只小鼠，使用無菌儀器在小鼠造模處留取皮膚組織，面積約1 cm×1 cm左右，分組固定保存于已序號標記的福爾馬林溶液中，脫水后石蠟包埋，然后切片，進行HE染色。

1.8 指標觀察

觀察每組小鼠皮損變化并予以皮損面積及嚴重程度指數(Psoriasis area and severity index，PASI)評分，酶聯免疫吸附測定(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測各組小鼠血清IL-17、IL-23的表達水平，HE染色觀察各組小鼠的皮膚病理改變。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 各組小鼠形態學觀察及PASI評分情況

密切觀察各組小鼠造模后的皮損情況，在第8天后可見模型組小鼠皮損處出現紅斑、大量鱗屑，且皮疹較為肥厚，表現為銀屑樣改變；阿維A膠囊組、銀屑平丸組、中西結合組小鼠皮損均有不同程度的緩解，其中中西結合組小鼠皮損改善最明顯，具體見圖1。與空白對照組相比，模型組、阿維A膠囊組、銀屑平丸組、中西結合組小鼠背部皮損的PASI評分均顯著升高(P<0.05)；與模型對照組相比，阿維A膠囊組、銀屑平丸組、中西結合組小鼠背部皮損的PASI評分均顯著降低(P<0.05)，其中中西結合組療效最佳(P<0.05)，具體見表1。

注：A：空白對照組；B：模型組；C：阿維A膠囊組；D：銀屑平丸組；E：中西結合組。

表1 各組小鼠PASI評分情況 分)

2.2 各組小鼠皮損組織病理學改變

各組小鼠皮損組織HE染色結果顯示，空白對照組皮膚組織結構較完整，可見清晰的角質層、顆粒層及基底層；模型組皮損組織可見明顯的角質層斷裂，大量的皮膚乳頭水腫。阿維A膠囊組、銀屑平丸組、中西結合組視野下可見角質層斷裂存在不同程度的改善，其中中西結合組改善程度較為明顯。具體見圖2。

2.3 各組小鼠血清炎性因子表達水平

ELISA結果顯示，阿維A膠囊組、銀屑平丸組、中西結合組小鼠血清IL-17、IL-23表達水平均顯著降低，其中中西結合組效果最佳(P<0.05)。具體見表2。

表2 各組小鼠血清IL-17、IL-23表達水平

注：A：空白對照組；B：模型組；C：阿維A膠囊組；D：銀屑平丸組；E：中西結合組。

3 討論

研究表明，銀屑病的發病機制主要與機體免疫相關，T淋巴細胞貫穿銀屑病病程的始終，T淋巴細胞可通過分泌不同的細胞因子，包括IL-17、IL-23、TNF-α等[12]。這些炎癥因子促使角質形成細胞不斷增殖分化產生鱗屑性斑塊，刺激血管不斷增殖、擴張，并使炎癥細胞浸潤而形成紅斑[13]。研究顯示，Treg細胞與Th17細胞之間關系失衡可能是銀屑病發病的新線索，在銀屑病患者的皮損中，Th細胞及其細胞因子較正常人群增加，而Treg細胞及其細胞因子則相對有所減少，其中Treg細胞在皮膚中能免疫耐受共生微生物，抑制炎癥的發展[14]。IL-17、IL-23均為T淋巴細胞所分泌，若闡明IL-17、IL-23炎癥因子在銀屑病發病過程中的作用，可能為銀屑病治療的新方向。

中醫學對銀屑病病因的認識最早可追溯至隋代，隋代醫家巢元方在《諸病源候論》中認為“干癬”以外感風邪為主因，夾雜寒濕之氣合而入里，侵襲人體肌腠，凝滯氣血，氣血失暢而為病，開創了銀屑病外邪致病的先河。唐宋醫家繼承并發展銀屑病外邪致病理論，唐代王燾在《外臺秘要》、宋代趙佶在《圣濟總錄》中均有提及[15]。湖南中醫藥大學第一附屬醫院席建元教授根據該病的病因病機，結合多年臨床經驗創立“涼血養陰，清熱解毒”的治療原則，并研發出銀屑平丸，長期臨床運用，廣受患者好評[16-17]。該藥物由生地黃、牡丹皮、紫草、丹參、白花蛇舌草、半枝蓮、大青葉、赤芍、防風、女貞子、旱蓮草、甘草組成。方中君藥生地黃甘而苦寒，以寒之性涼解血熱，養陰之效顧護津液，使邪氣祛除不損正氣；赤芍、丹皮、丹參味苦性微寒，均以血治，達肝經清郁滯之火毒，入血分清蘊結之瘀熱，涼解血熱又能消散瘀血，防止熱與血結；紫草甘寒同入血分，清解血分熱毒，透泄斑疹；白花蛇舌草酸涼，半枝蓮、大青葉苦寒，三藥相合，清泄血熱，涼解火毒，專攻火熱毒盛，共為臣藥。血熱內蘊，煎熬津液，津傷不能濡潤肌膚，女貞子、墨旱蓮互為佐藥入肝腎以滋養肝腎之陰，益下榮上，養陰潤燥以生津化液榮養肌膚。防風辛散驅邪外出，且為治風潤藥，功善疏風止癢；甘草善清熱解毒調和諸藥，與防風共為使藥，諸藥相合，共奏涼血養陰、清熱解毒之功。

本研究顯示，銀屑平丸聯合阿維A膠囊可明顯改善PS小鼠模型的皮損情況，均較單獨使用銀屑平丸或阿維A膠囊療效更佳，作用機制可能與抑制PS小鼠模型血清IL-17、IL-23炎性因子表達水平相關，但其深入機制仍需進一步的實驗研究予以闡明。