利用高密度Bin圖譜定位水稻抽穗期劍葉葉綠素含量QTL

趙凌，張勇，魏曉東，梁文化，趙春芳，周麗慧，姚姝，王才林，張亞東

利用高密度Bin圖譜定位水稻抽穗期劍葉葉綠素含量QTL

趙凌，張勇，魏曉東，梁文化，趙春芳，周麗慧，姚姝，王才林，張亞東*

江蘇省農業科學院糧食作物研究所/江蘇省優質水稻工程技術研究中心/國家水稻改良中心南京分中心，南京 210014

【目的】挖掘新的控制水稻葉綠素含量的相關位點和基因，為水稻葉綠素含量的遺傳機制研究提供理論基礎。【方法】利用劍葉葉色存在明顯差異的粳稻TD70和秈稻Kasalath雜交構建的包含186個株系的重組自交系群體為供試材料，通過對兩親本及RIL群體重測序，構建了包含12 328個Bin標記的高密度遺傳圖譜。RIL群體及親本分別于2011和2020年正季在江蘇省農業科學院種植。抽穗后第3天使用葉綠素儀測定劍葉SPAD值。使用IciMappingv3.4軟件完備區間作圖法，對控制水稻抽穗期劍葉葉綠素含量的QTL進行鑒定。利用便攜式光合儀測定RIL群體中20個SPAD極端株系的水分利用效率、蒸騰速率、氣孔導度和凈光合速率等光合作用參數。【結果】2年共檢測到19個抽穗期劍葉葉綠素含量相關QTL，分別分布在除第8、9和10染色體外的其他9個染色體上。單一QTL貢獻率為3.09%—13.13%，LOD值為2.74—14.08。通過物理位置比對，發現其中10個QTL與前人定位到的葉綠素含量相關位點在相同或鄰近區域。和2年均被檢測到，表現出較強的穩定性。位于第2染色體的7.63—7.71 Mb處，2年LOD值分別為14.08和7.93，貢獻率分別為13.13%和7.94%。位于第5染色體的23.44—23.49 Mb處，2年LOD值分別為4.31和3.76，貢獻率分別為3.57%和4.82%。結合功能注釋和親本間序列分析，分別在和染色體區間內找到2個與劍葉葉綠素含量相關的基因和。這兩個基因的核苷酸序列在兩親本間均存在差異。編碼水稻天冬氨酸氨基轉移酶（AAT1），是水稻氮代謝途徑中的重要酶，與蛋白質及氨基酸含量有關。編碼葉面斑點相關蛋白，推測與葉片顏色有關。根據在CDS+273 bp有無突變對RIL群體進行等位型分類。在20個SPAD極端株系中，不同等位型株系的劍葉SPAD值和水分利用效率、蒸騰速率、氣孔導度和凈光合速率等光合作用指標均存在顯著差異。【結論】共檢測到19個控制水稻抽穗期劍葉葉綠素含量QTL，鑒定了2個穩定存在的QTL——和，在這兩個QTL區間篩選到2個可能調控水稻抽穗期劍葉葉綠素含量的基因。其中1個（）不同等位型的光合作用參數在20個極端SPAD株系中存在顯著差異，推測其為最可能的候選基因，可用于后續劍葉葉綠素調控基因的功能研究。

水稻；重組自交系；高密度Bin圖譜；葉綠素含量；QTL

0 引言

【研究意義】水稻是世界主要三大糧食作物之一，其產量主要來自于葉片光合作用的產物。葉綠素是水稻光合作用的物質載體，是將光能轉化為化學能的主要元素，葉綠素含量是直接決定光合潛力和初級生產能力的因素[1-2]。提高葉片中葉綠素含量可以提高光合速率，進而提高產量。此外，作物葉片葉綠素含量不僅可以作為營養水平的指標（如氮素含量），還可以指示作物對逆境脅迫的承受程度等[3-4]。有研究報道，劍葉在作物光合作用中起著積極的作用，對產量具有重要的促進作用[5-6]。因此，改善水稻劍葉的葉綠素含量是提高水稻生物量和籽粒產量的有效途徑。【前人研究進展】近年來，水稻葉綠素相關性狀的研究越來越受到重視，報道了苗期、分蘗期、齊穗期等時期以及不同氮素供應、干旱、高溫等各種脅迫下水稻葉綠素含量和葉綠素a/b比等相關性狀的QTL定位結果，克隆了、等一些相關基因[7-12]。QTL定位是目前剖析水稻復雜數量性狀最有效的工具之一。傳統分子標記構建的遺傳圖譜密度較低，定位區間過大，容易導致精細定位和基因克隆困難。隨著基因組測序技術的快速深入發展，水稻遺傳育種已經進入高通量、大規模的全基因組水平時代。SNP標記由于分布廣泛、多樣性高、數量大等特點，在水稻復雜數量性狀研究中得到了高度重視和廣泛應用。取一定數量的連續SNP標記作為判斷染色體重組事件的最小單位（recombination bin），判斷子代每個Bin的來源，得到每個子代的全基因組物理圖譜，所構建出的遺傳圖譜稱之為Bin圖譜[13]。Bin圖譜是基于SSR/RFLP標記的傳統遺傳圖譜后的新一代遺傳圖譜，通過高通量測序進行，自動化程度高、構建時間短、精確度高，可以直接進行QTL定位后續的候選基因篩選和分子標記開發[14]。【本研究切入點】已經定位和克隆的QTL/基因并不能完全解釋水稻葉綠素相關性狀的遺傳及變異，其分子機理還需要更加深入地研究。【擬解決的關鍵問題】本研究利用抽穗期劍葉葉綠素含量存在顯著差異的秈稻Kasalath和粳稻TD70衍生的重組自交系群體（RIL）為作圖群體，構建了包括12 328個Bin標記的高密度連鎖圖譜，定位和分析控制抽穗期劍葉葉綠素含量的QTL，尋找一些新的、穩定的葉綠素含量相關位點，以期為水稻葉綠素含量相關基因的鑒定提供基礎，為水稻分子標記育種提供新的篩選靶標。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以一個來源于天鵝谷///9520//（72-496/蘇御糯）的粳稻品系TD70和秈稻品種Kasalath為親本配制組合。2005年夏從F1單株收取自交種子，以單粒傳方法構建成由186個株系組成的RIL群體[15]。基因型調查為F10世代，表型調查為F7和F11世代。

1.2 田間試驗及葉綠素測定

分別于2011和2020年于江蘇省農業科學院糧食作物研究所試驗田種植186個RIL群體及2個親本，隨機區組設計。2011年和2020年均于5月10日播種，6月10日移栽，每個株系種植4行，每行7株，單本栽插，行株距為25 cm×16.7 cm。移栽后至收獲不施肥，擱田后，田間保持干干濕濕至收獲，其他田間管理按常規栽培管理方法。

使用葉綠素儀（SPAD-502，Monito，Japan）測量186個株系及親本抽穗期的劍葉葉綠素含量。以每株系小區內50%單株始穗日期為該株系的抽穗日期。每個株系抽穗后第3天測定劍葉SPAD值。隨機調查3個代表性植株，每個植株選擇位置一致的3張劍葉，每張葉片測量不同位置的5個SPAD值，取平均值作為該植株的葉綠素含量SPAD值，3個植株SPAD的平均值作為整個株系的葉綠素含量值。下文中葉綠素含量均用SPAD值來表示。

1.3 連鎖圖譜構建與QTL定位

對186個粳稻TD70與秈稻Kasalath的RILs群體進行全基因組重測序和基于SNP的Binmap連鎖圖譜構建。構建的高密度遺傳圖譜含有12 328個Bin標記，各染色體Bin標記數為763—1 367個，標記間平均物理距離為30.26 kb[16]。利用QTL IciMapping V3.4軟件，采用完備區間作圖法（inclusive composite interval mapping，ICIM）在全基因組范圍內進行掃描[17]，掃描步長為1.0 cM，檢測控制劍葉葉綠素含量的QTL。以LOD2.5作為閾值檢測QTL的存在，QTL的命名方法參照McCouch等[18]規則。

1.4 光合速率的測定

在RIL群體中選取劍葉葉綠素含量極高和極低的株系各10個，在成熟期，利用便攜式光合儀（Li-6800，LI-COR，USA）于上午9：00—11：00進行光合參數測定。測量時，光照有效輻射和CO2含量分別設置為1 500 μmol·m-2s-1和400 ppm。每個株系測定3個植株作為生物學重復。

2 結果

2.1 RIL群體及其親本的劍葉葉綠素含量表型變異

2011和2020年RIL群體及其雙親的劍葉葉綠素含量的表型變異見圖1。親本TD70劍葉的SPAD平均值分別為48.2和46.2，而Kasalath的劍葉SPAD平均值為34.50和38.10，2年不同環境下TD70的劍葉葉綠素含量均極顯著高于Kasalath（＜0.01，表1）。

2011年RIL群體的劍葉葉綠素含量SPAD均值為42.08，劍葉葉綠素含量最高的株系達到49.0，最低的株系為30.51（表1）。2020年RIL群體的劍葉葉綠素含量SPAD均值為40.58，劍葉葉綠素含量最

圖1 親本及部分RIL群體株系抽穗期的劍葉葉色

高的株系達到50.83，最低的株系為27.53（表1），群體中劍葉葉綠素含量存在明顯的超親現象。2011和2020年RIL群體的劍葉葉綠素含量峰度和偏度的絕對值都小于1，呈連續性并為正態分布，表現出數量性狀的遺傳特點（圖2），可以對其進行QTL定位分析。

表1 親本與重組自交系群體抽穗期劍葉的葉綠素含量

K：Kasalath；T：TD70

2.2 劍葉葉綠素含量的QTL檢測

對RIL群體進行劍葉葉綠素含量的QTL檢測，2年共檢測到19個QTL，分別分布在除第8、9和10染色體外的其他9個染色體上（表2）。其中，2011年檢測到8個QTL，分布于第1、2、3、5、6和7染色體，LOD值介于2.74—14.08，貢獻率介于3.57%—13.13%。2020年檢測到13個QTL，分別位于第1、2、3、4、5、6、11和12染色體，LOD值介于2.84—9.19，貢獻率為3.09%—10.95%。其中2個QTL（和）在2年均被檢測到。

位于第2染色體的7.63—7.71 Mb處，在2年環境中均被檢測到，表現出較強的穩定性。在2011年可解釋13.13%的表型變異，是2011年檢測到效應最大的QTL，來自于Kasalath的等位基因可使劍葉葉綠素含量的SPAD值升高1.81。在2020年檢測到LOD值為7.93，可解釋7.94%的表型變異。來自于Kasalath的等位基因可使劍葉葉綠素含量的SPAD值升高1.24。

2年均被檢測到的QTL位于第5染色體的23.44—23.49 Mb處，在2011年檢測到LOD值為4.31，可解釋3.57%的表型變異，來自于TD70的等位基因可使劍葉葉綠素含量SPAD值升高0.91。在2020年可解釋4.82%的表型變異，來自于TD70的等位基因可使劍葉葉綠素含量SPAD值升高0.86。

第1染色體上共有4個影響劍葉葉綠素含量的QTL，其中和在2011年被檢測到，分別位于第1染色體的25和31 Mb處，LOD值約為6.4，分別解釋6.47%和5.55%的表型變異，增效基因均來自于Kasalath。和在2020年被檢測到，位于第1染色體3—4 Mb，LOD值都在8以上，效應較大，解釋的表型變異大于9%，增效等位基因均來自于TD70，可使劍葉葉綠素含量SPAD值升高1.42和1.32。

表2 檢測到控制抽穗期劍葉葉綠素含量的QTL

加性效應值為正值，表明增效等位基因來源于TD70。*：在2年間重復檢測到的QTL。下同

Positive additive effect showed that source of favorable allele came from TD70.*: the QTL was detected in both two years.The same as below

第2染色體上共有3個控制劍葉葉綠素含量的QTL，除2年均被檢測到外，2011和2020年分別檢測到和，LOD值為2.74和3.27，均為來自于Kasalath的等位基因，可使劍葉葉綠素含量的SPAD值升高1.14和1.28。

第3染色體在2011和2020年各檢測到1個QTL（和），分別位于第3染色體25 Mb和頂端，LOD值均超過4.5，解釋的表型變異大于9%，均為來自于TD70的增效等位基因，可使劍葉葉綠素含量的SPAD值升高0.9左右。

第4、7和11染色體2年均只檢測到1個QTL，其中，2011年檢測到，2020年檢測到和。是所有檢測到的位點中增效效應最大的位點，位于第7染色體的24.3 Mb處，來自于TD70的增效等位基因可使劍葉葉綠素含量的SPAD值升高2.37。和分別解釋7.7%和3.89%的表型變異。

除在2年中均被檢測到外，第5染色體上在2020年還檢測到，位于第5染色體的頂端，LOD值4.72，來自于TD70的等位基因可使劍葉葉綠素含量的SPAD值升高1.11。

2011和2020年分別在第6染色體上檢測到1個QTL。2011年檢測到的位于29.4 Mb，LOD值4.67，解釋3.92%的表型變異；2020年檢測到的位于24.4 Mb左右，LOD值為5.63，解釋5.68%的表型變異，它們均攜帶來自Kasalath的增效等位基因。

在第12染色體上共檢測到3個QTL，均于2020年被檢測到。其中，位于8.13—8.45 Mb，攜帶來自于TD70的增效等位基因；另外2個QTL（和）位于25 Mb相鄰的區域均攜帶來自Kasalath的等位基因，可升高SPAD值1左右。

2.3 候選基因的篩選

利用水稻基因組注釋數據庫（http://rice.uga.edu/）對2年重復檢測到的影響劍葉葉綠素含量位點和區間內的基因進行功能注釋（表3）。

表3 2個重復檢測到QTL區間內基因的注釋

位于第2染色體的7.63—7.71 Mb處，該區間內經過查詢，共有8個注釋基因，除去不轉錄蛋白、假定蛋白等基因外，還有4個注釋有功能的基因。比較這4個基因在2個親本基因組中的序列，發現除基因外，其他3個基因的編碼區在親本間不存在錯義突變。是水稻天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AAT1）基因，編碼的天冬氨酸氨基轉移酶（EC 2.6.1.1）是水稻氮代謝途徑中的重要酶。已有報道與控制蛋白質和氨基酸含量的QTL有對應關系[19]。由于氮代謝和水稻葉色有非常重要和直接的關系，初步推測其可能與葉片顏色有關[20]。進一步序列比較發現TD70和Kasalath的存在20處堿基差異，其中11處為單堿基轉換。有1處錯義突變發生在CDS+273 bp（T/C），編碼的氨基酸分別為Ser和Pro。根據在CDS+273 bp有無突變對RIL群體進行等位型分類，在CDS+273 bp處無突變的命名為HapA，堿基T突變為C的株系命名為HapB。分析20個葉綠素含量極端株系的光合速率測定結果發現，與HapA相比，HapB的株系顯著降低了劍葉SPAD值和葉綠素含量，同時HapB株系的水分利用效率、蒸騰速率、氣孔導度和凈光合速率等光合作用指標均顯著降低（圖3）。推測是水稻光合作用通路中比較重要的功能基因。

位于第5染色體的23.44—23.49 Mb處，經過數據庫查詢，該區間內共有9個注釋基因，除去不轉錄蛋白、假定蛋白等基因外，發現有1個基因（）注釋是葉面斑點基因，推測與葉片顏色有關。基因序列分析發現，除外，其他基因的編碼區在2個親本基因組中不存在錯義突變。的產物是可表達的蛋白，其涉及的生物學進程包括細胞內骨架、泛素連接酶催化活性等。TD70和Kasalath的有5個位點變異，其中1個錯義突變發生在CDS+571 bp（C/A），編碼的氨基酸分別為Asp和Glu。

HapA：AAT1在CDS+273 bp處為T；HapB：AAT1在CDS+273 bp處為C。不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）

3 討論

葉綠素含量是水稻生長的重要農學參數。在一定的養分水平下，葉綠素含量代表了水稻的生產能力。當葉綠素含量較高且相對穩定期較長時，葉片能夠吸收更多的光能，從而更好地發揮產量潛力。在生產實踐中，盡管葉片葉綠素含量可以判斷水稻植株營養狀況、光合能力、逆境脅迫抗性，但作為多基因控制的復雜數量性狀，遺傳復雜，而且受氮肥等因素影響較大，在育種中很難有效選擇。目前已經定位和克隆了一些控制不同時期水稻葉片葉綠素含量的QTL，在基因克隆方面也取得了進展。但鑒定到的位點大都利用初級作圖群體，標記數目較少往往導致QTL區間較大，很難進行深入的效應估計和候選基因鑒定以及標記輔助選擇。本研究通過高密度的Bin圖譜對水稻抽穗期劍葉的葉綠素含量進行QTL定位分析，希望能夠為剖析其遺傳規律提供新的研究基礎。

3.1 Bin圖譜定位水稻復雜性狀QTL具有明顯的優勢

基于測序技術構建的Bin圖譜與傳統遺傳圖譜相比，不僅標記密度更高，能夠提供準確的物理位置，而且能夠精確檢測雙交換事件，使QTL定位更準確，區間更小。本研究采用基因分型測序（genotyping by sequencing，GBS）技術構建的高密度Bin圖譜共包含12 328個Bin標記，標記間平均物理距離為30.26 kb，使得直接從定位區間篩選候選基因成為可能。

已有研究表明，QTL的緊密連鎖或者成簇分布可能是水稻葉綠素含量的遺傳基礎之一[21-22]。當LOD值超過閾值的一段區域內存在多個峰值時，通過傳統遺傳圖譜很難區分開，往往導致效應較小的位點被遮蓋[23]。本研究在位置相鄰的區域定位到了控制劍葉葉綠素含量的多個QTL，如和分別位于第2染色體35.03—35.10 Mb和35.12—35.15 Mb；和分別位于第12染色體25.50—25.54 Mb和25.70—25.74 Mb。此外，本研究鑒定的一些位點和已知水稻葉綠素含量相關QTL或者基因之間也存在這種位置相鄰的現象，如：位于第3染色體25.41—25.44 Mb處，而已經克隆的葉綠素b還原酶基因（）位于25.52 Mb。和位點附近，也有影響葉綠素含量的谷氨酸-1-半醛轉氨酶基因（glutamate -1-semialdehyde aminotransferase，GSA）、羥甲基后膽色素原合成酶基因（）和硝酸鹽轉運蛋白基因。位于第5染色體23.44—23.49 Mb處，而已經克隆的水稻葉色相關基因（）位于23.35 Mb（http://www.gramene.org），編碼谷氨酸-1-半醛轉氨酶，具有一個吡哆醛磷酸鹽介導的轉移酶結構域，在葉綠素生物合成從谷氨酰到葉綠素a的過程中發揮作用[24]。董驥馳等[25]利用02428和玉針香高密度Bin圖譜進行水稻抽穗期QTL定位，發現定位的抽穗期QTL之間存在這種位置相鄰的現象。說明利用Bin圖譜進行QTL檢測可將位置非常臨近的QTL有效地分離開來，測序分型得到的大量SNP標記還可以快速應用于分子育種，在水稻復雜性狀的定位、候選基因鑒定和標記輔助選擇方面具有非常大的應用前景。

3.2 本研究與前人定位QTL的比較

諸多研究者利用不同的遺傳群體和標記，定位到很多控制不同時期、不同部位葉片的葉綠素含量相關QTL，比較發現這些位點的貢獻率絕大多數在10%以下，主效基因較少，表明葉綠素含量主要由微效QTL控制，這和葉綠素a和葉綠素b通過多個步驟合成相一致[22]。本研究應用水稻秈粳交RIL群體構建高密度Bin連鎖圖譜，2年共檢測到19個控制抽穗期劍葉葉綠素含量的QTL，貢獻率為3.09%—13.13%，與上述研究結果基本一致，反映了葉綠素含量這一生理性狀遺傳的復雜性。

通過遺傳圖譜的對比（http://www.gramene.org），發現本研究定位到的一些劍葉葉綠素含量位點和已知影響水稻葉綠素含量的位點間有著區間的重疊（表4）。如本研究檢測到的位于第1染色體31.76—31.83 Mb，在該區域檢測到多個相關QTL。胡頌平等[26]利用珍汕97B/IRAT109的RILs群體在30.1—33.86 Mb檢測到控制干旱脅迫下的劍葉或倒2葉葉綠素含量的QTL，表型貢獻率為6.46%，LOD值為4.56。Teng等[27]利用ZYQ8/JX17的DH群體，檢測到控制分蘗期上部展開葉葉綠素含量的，位于30.06—32.06 Mb。劉進等[28]利用沈農0530-9/北陸129的F2及F2:3群體，在這個區域也檢測到了控制拔節期劍葉葉綠素含量的QTL。此外，胡茂龍等[29]利用日本晴/Kasalath//日本晴的BILs群體，在第1染色體25.13—26.19 Mb區間檢測到控制抽隨后7 d葉綠素含量的位點，表型貢獻率為10.7%，LOD值為3.34，和本研究的在同一區域內。

在2年均被檢測到的位點和附近也發現有多個葉綠素含量相關位點。在第2染色體7.63—7.71 Mb內的位點，表型貢獻率為13.13%，LOD值為14.08，是本研究定位到的效應最大的葉綠素含量位點。在其所在區域有多個相關QTL被檢測到，如利用沈農265/麗江新團黑谷的RILs群體、崗46B/A232的RILs群體、ZS97/WY2的DHs群體，以成熟期、分蘗期劍葉葉綠素含量和發育期劍葉葉綠素b含量為表型，分別在第2染色體2.88—9.47、5.20—8.76和7.43—11.41 Mb區間內檢測到了相關QTL[11, 30-31]。這些QTL區間較大，都覆蓋了本研究定位的。第5染色體上的位點也是相同的情況，利用窄葉青8號/京系17的DHs、Dular/Lemont RILs、十和田/麗江新團黑谷RILs分別檢測到了控制齊穗期劍葉葉綠素b含量、齊穗期劍葉葉綠素含量和孕穗期劍葉葉綠素b含量的位點，分別在第5染色體19.27—31.45 Mb和3.89—24.09 Mb附近，覆蓋了本研究所在的23.44—23.49 Mb區間[32-35]。和不僅在本研究中穩定存在，而且位于多個不同群體鑒定到的葉綠素含量QTL的區域內，值得進一步深入研究。

位于第4染色體23.3 Mb，表型貢獻率為7.71%，LOD值為7.47，在該區域檢測到多個已知的葉綠素含量相關QTL，與分蘗期劍葉、苗期的葉綠素含量、抽穗5和25 d葉綠素含量的降低等性狀相關[30, 36, 38]。已經定位的苗期葉綠素含量QTL（AQAE002）覆蓋了此區域[36]。、、這3個位點分別和已經發表的控制干旱脅迫下的劍葉或倒2葉葉綠素含量、抽穗后5 d和25 d葉綠素含量的降低、成熟期劍葉的葉綠素含量QTL存在區域重疊現象，其他QTL所在區域暫時未發現相關報道。

表4 本研究定位的QTL和已知葉綠素含量相關位點的位置比較

4 結論

檢測到19個控制抽穗期劍葉葉綠素含量的QTL。鑒定了2個穩定存在的QTL——和。編碼水稻天冬氨酸氨基轉移酶的可能是調控抽穗期劍葉葉綠素含量的候選基因。

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Mapping of QTLs for Chlorophyll Content in Flag Leaves of Rice on High-Density Bin Map

ZHAO Ling, ZHANG Yong, WEI XiaoDong, LIANG WenHua, ZHAO ChunFang, ZHOU LiHui, YAO Shu, WANG CaiLin, ZHANG YaDong*

Institute of Food Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu High Quality Rice R&D Center /Nanjing Branch of China National Center for Rice Improvement, Nanjing 210014

【Objective】Finding new loci and genes related to rice chlorophyll content, and providing new theoretical basis for the research on the genetic mechanism of rice chlorophyll content.【Method】A recombinant inbred line (RIL) population containing 186 lines was constructed by crossing the japonica rice TD70 and the indica rice Kasalath with obvious difference in the chlorophyll content of the flag leaf.The two parents and RIL population were re-sequenced to construct a high-density genetic linkage map with 12 328 recombination Bin markers.The RILs and two parents were planted in fields at the Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, in Nanjing in 2011 and 2020.The contents of chlorophyll of flag leaves were directly measured using the chlorophyll meter SPAD-502 on the 3rdday after heading.QTLs that control the chlorophyll content of the flag leaf at the heading stage of rice were detected by IciMappingv3.4 software with inclusive compound interval mapping method.The photosynthesis parameters of 20 SPAD extreme strains in the RIL population were measured with a portable photosynthesis system.【Result】19 QTLs controlling chlorophyll content of flag leaves were detected on 9 chromosomes except Chr.8, Chr.9 and Chr.10 in two years.The phenotype variation explained (PVE) of single QTL ranged from 3.09% to 13.13%, LOD value ranged from 2.74 to 14.08.After comparing the physical positions, 10 QTLs were found to locate in the same interval or adjacent to previously QTLs.andwere detectedevery year showing their genetic stabilitywas mappedbetween the 7.63-7.71 Mb on chromosome 2, and the two-year LOD values are 14.08 and 7.93 with the PVE 13.13% and 7.94%, respectively.was mappedbetween the 23.44-23.49 Mb on chromosome 5, and the two-year LOD values are 4.31 and 3.76, respectively.After the annotation and sequences analysis of genes located in the region ofandtwo genes,and, were found to be associated with chlorophyll content of flag leaves in the rice.There are differences in sequences of the two genes between TD70 and Kasalath.is thegene encoding the Aspartate Aminotransferase, whichis an important enzyme in nitrogen metabolism and related to protein and amino acid content of rice.encodes protein relating to spotted leaf, which might associate with leaf color.Based on the mutation ofat CDS+273 bp, the haplotypes ofwere classified in RIL population.Among the 20 extreme SPAD RIL lines,there were significant differences between different haplotype of【Conclusion】19 QTLs associated with chlorophyll content in flag leaf at heading stage of rice were detected and two stable QTL loci,andwere identified.Two candidate genes were obtained after annotation and sequence comparison.One of them,, was considered as the most possible candidate gene after effort analysis of different haplotypes in photosynthetic efficiency.The QTLs and gene we obtained could be used for subsequent functional studies of flag leaf chlorophyll regulation and molecular marker breeding.

rice (L.); recombinant inbred lines; high-density bin map; chlorophyll content; QTL

2021-10-20；

2021-11-25

江蘇省重點研究發展計劃（BE2019375)

趙凌，Tel：025-84390306；E-mail：zhaoling@jaas.ac.cn。通信作者張亞東，Tel：025-84390314；E-mail：zhangyd@jaas.ac.cn

（責任編輯 李莉）