基于代謝組學的‘永春佛手’烏龍茶化學成分解析

彭佳堃，戴偉東，顏涌泉，張悅，陳丹，董明花，呂美玲，林智

基于代謝組學的‘永春佛手’烏龍茶化學成分解析

1中國農業科學院茶葉研究所/農業部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，杭州 310008；2中國農業科學院研究生院，北京 100081；3永春縣農業農村局，福建泉州 362600；4安捷倫科技（中國）有限公司，北京 100102

【】不同茶樹品種制作的烏龍茶風味品質和內含成分具有明顯差異。本研究結合非靶向代謝組學、化合物定量分析、多元統計學等方法比較‘永春佛手’‘鐵觀音’和‘水仙’烏龍茶的化學成分差異，分析‘永春佛手’烏龍茶的特征性化學成分，并探討茶樹品種對烏龍茶內含成分和感官品質的影響。以‘永春佛手’品種為主要研究對象，‘鐵觀音’和‘水仙’品種為對照，三者均加工制成清香型、濃香型和陳香型烏龍茶，采用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜（UHPLC-Q-TOF/MS）進行非靶向代謝組學分析，對不同品種烏龍茶的差異化合物進行鑒定和篩選，并采用超高效液相色譜儀、氨基酸分析儀和超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱質譜（UHPLC-Q-Orbitrap-MS）對茶葉中主要化學成分和不同品種烏龍茶間差異化合物進行定量分析。相比于同一香型的對照品種烏龍茶，‘永春佛手’具有相對較高的氨基酸總量和茶氨酸含量，兒茶素類化合物總量和咖啡堿含量在清香型和濃香型的不同品種間無顯著差異，在陳香型中均以‘永春佛手’烏龍茶含量最高，沒食子酸含量在3種香型中均呈現‘水仙’>‘永春佛手’>‘鐵觀音’。代謝組學結合多變量統計表明，不同品種制成的烏龍茶化合物表型具有明顯差異。清香型、濃香型和陳香型烏龍茶中，‘永春佛手’與對照品種烏龍茶間的差異化合物分別為50、59、47個，其中共同差異化合物有23個，包括14個黃酮（醇）糖苷、5個兒茶素類化合物及其衍生物、1個脂類、1個生物堿、1個有機酸和1個氨基酸類化合物。進一步對茶葉中常見的20個黃酮（醇）糖苷組分進行定量分析，結果顯示‘永春佛手’烏龍茶中14個黃酮（醇）糖苷組分的含量顯著高于對照品種烏龍茶，其含量是相同香型‘鐵觀音’品種烏龍茶的1.4—14.6倍，是‘水仙’品種烏龍茶的1.3—18.0倍。在定量的4類黃酮（醇）糖苷中，槲皮素糖苷均為主要的黃酮（醇）糖苷組分，含量高于山柰酚糖苷、楊梅素糖苷和芹菜素糖苷。感官審評分析表明較高含量的黃酮（醇）糖苷并未顯著增強茶湯的澀味。代謝組學方法可以有效地對不同品種制作的烏龍茶進行化合物表征。‘永春佛手’‘鐵觀音’和‘水仙’按照相同工藝制成的烏龍茶具有較為明顯的化學成分差異，其中黃酮（醇）糖苷類化合物差異最為顯著，具有較高含量的黃酮（醇）糖苷類成分是‘永春佛手’烏龍茶在化學成分方面的一個重要特征。黃酮（醇）糖苷類成分有望作為判別指標用于烏龍茶制作品種的判別。

烏龍茶；品種特征成分；代謝組學；液質聯用；黃酮（醇）糖苷

0 引言

【研究意義】‘永春佛手’茶（YCFS）是以福建省永春縣當地茶樹品種‘佛手’（(L.) O. Kuntze cv. Foshou）的鮮葉為原料制成，其葉片與‘佛手柑’（L. var.Swingle）的葉子相似，同時其干茶沖泡后呈現類似佛手柑的果香，所以被稱為‘佛手’，是永春縣地理標志產品[1]。根據國家標準GB/T 30357.7—2017 “烏龍茶第七部分：佛手”中毛茶加工工藝的不同，‘永春佛手’烏龍茶可分為清香型、濃香型和陳香型。清香型‘永春佛手’烏龍茶干茶烏綠潤，香氣清高，滋味醇厚甘爽，香櫞香明顯；濃香型干茶青褐潤，有熟果香，滋味醇厚回甘；陳香型干茶烏褐潤，陳香濃郁，滋味爽滑回甘[2]。‘鐵觀音’烏龍茶也有3種香型之分[3]，不同品種茶樹制成的同一香型烏龍茶具有相似之處，同時還有品種特色，如清香型鐵觀音干茶砂綠，香氣清高，但是其滋味和香型有別于清香型‘永春佛手’烏龍茶，滋味上具有獨特的“音韻”，香氣無佛手的香櫞果香。不同品種制成的烏龍茶具有明顯的品種特征，其化學成分的差異起到關鍵作用。本研究以不同品種茶樹鮮葉分別制成清香型、濃香型、陳香型烏龍茶，從內含成分對茶葉生化特征進行解析和比較，從而探究不同品種茶樹制成的烏龍茶化學成分差異和品質形成機理，為烏龍茶風味的品種獨特性提供理論基礎。【前人研究進展】多酚類、氨基酸類、糖類、生物堿類等內含成分是構成茶葉風味品質的物質基礎[4]。相關研究表明兒茶素總量[5]、兒茶素衍生物[6]、脂肪酸[7]等物質在不同茶樹品種鮮葉中的含量具有明顯差異。對武夷山14個適制烏龍茶的茶樹品種鮮葉研究表明，兒茶素類和黃酮（醇）糖苷等成分被認為有望作為茶葉品種鑒別的關鍵代謝物[8]。這些內含成分的差異最終導致不同品種鮮葉加工而成的茶葉具有不同的風味品質[9]和保健功效[10]。對11個茶樹品種制成的紅茶分析發現，‘英紅1號’和‘英紅9號’品種制成的紅茶具有較高含量的兒茶素類、兒茶素衍生物、酚酸，而黃酮糖苷、游離糖和氨基酸含量較低，其滋味、香氣和湯色的評分均高于其他品種[11]。不同茶樹品種的鮮葉根據相同工藝加工成綠茶[12]、黑茶[13]、白茶[14]等均會呈現不同的品質特征。目前，通過代謝組學對不同茶樹品種制成的烏龍茶進行全面分析的文獻報道較少。代謝組學以樣品中的小分子代謝產物為研究對象，能夠全面、高效地對生物體內的代謝產物進行表征，已廣泛應用于茶葉生長發育[15]、采收[16-17]、加工[18-19]和貯藏[20-21]等過程中化學成分的檢測和鑒定，極大地促進了茶葉的品質化學研究。【本研究切入點】目前對于烏龍茶的研究主要集中在‘鐵觀音’[17,21]、‘大紅袍’‘肉桂’[8]等較為知名的品種；永春‘佛手’是永春縣主要栽培品種，同時也是閩南代表性的一類烏龍茶，但其化學成分和品質特征研究較少。代謝組學方法結合化合物絕對定量能夠全面、準確地對茶葉內含物質進行解析并篩選特征化合物。【擬解決的關鍵問題】本研究以‘永春佛手’‘鐵觀音’和‘水仙’品種為研究對象，制成不同香型的烏龍茶，開展主要化學成分定量分析和代謝組學檢測，結合化學計量學篩選差異成分，闡明‘永春佛手’相較于‘鐵觀音’和‘水仙’烏龍茶的化學成分特征，探究茶樹品種對烏龍茶品質的影響。

1 材料與方法

試驗于2020年在中國農業科學院茶葉研究所和北京安捷倫科技有限公司進行。

1.1 試驗材料

取福建省永春縣同一產地的‘永春佛手’（YCFS）、‘鐵觀音’（TGY）（cv. Tieguanyin）和‘水仙’（SX）（cv. Shuixian）品種鮮葉，按照清香型和濃香型烏龍茶工藝進行加工，并搜集3個品種的陳香型烏龍茶。3種香型烏龍茶均經歷曬青、做青（涼青和搖青）、殺青、包揉與烘焙的加工步驟。清香型烏龍茶做青程度較輕，通過較低溫（80—90℃）烘焙而成；濃香型烏龍茶做青程度高于清香型烏龍茶，并經過高溫（90—100℃）焙火而成；陳香型烏龍茶由對應品種的清香型烏龍茶貯藏5年以上形成。樣品具體包括：清香型‘永春佛手’烏龍茶6個樣品、作為對照的清香型‘鐵觀音’和‘水仙’烏龍茶各1個；濃香型‘永春佛手’烏龍茶6個樣品、作為對照的濃香型‘鐵觀音’和‘水仙’烏龍茶各1個；陳香型‘永春佛手’‘鐵觀音’和‘水仙’烏龍茶樣品各1個，貯藏時間均為10年。以上共19個樣品，每個樣品取3個平行重復。

1.2 主要試驗儀器和試劑

儀器：氨基酸分析儀（S-433D，Sykam，德國）；超高效液相色譜（Acquity H-Class，Waters，英國）；超高效液相色譜串聯四級桿飛行時間質譜（UHPLC- Q-TOF/MS，Agilent Tech.，美國）；紫外分光光度計（UV-3600，Shimadzu，日本）；超高效液相色譜四極桿靜電場軌道阱質譜（UHPLC-Q-Orbitrap-MS，ThermoFisher，美國）。

試劑：氨基酸、兒茶素類化合物、沒食子酸、槲皮素3-O-葡萄糖苷（quercetin 3-O-glucoside）、槲皮素 3-O-半乳糖苷（quercetin 3-O-galactoside）、山柰酚 3-O-半乳糖苷（kaempferol 3-O-galactoside）、山柰酚 3-O-蕓香糖苷（kaempferol 3-O-rutinoside）、牡荊素（vitexin）、異牡荊素（isovitexin）、楊梅素 3-O-半乳糖苷（myricetin 3-O-galactoside）標準品和色譜級乙腈、甲醇購自Sigma-Aldrich；咖啡堿購自Enzo Life Sciences；甲酸（>99.0%）購自TCI公司；AlCl3購自美興化工股份有限公司；茶氨酸、蘆丁、槲皮素 3-O蕓香糖苷（quercetin 3-O-rutinoside）購自百靈威公司；去離子水為Milli-Q超純水。

1.3 試驗方法

1.3.1 氨基酸、兒茶素類、咖啡堿和沒食子酸含量測定 游離氨基酸組分使用氨基酸分析儀檢測，參考Yang等[22]的處理方法，在Na+型磺酸基強酸陽離子交換樹脂上分離，流速為0.25 mL·min-1。波長設置為570和440 nm，柱溫40℃，通過與氨基酸標準溶液比較峰保留時間來定性，用外標法測定濃度。參考課題組前期已建立的方法[15]，采用Acquity H-Class測定兒茶素類化合物、咖啡堿和沒食子酸。色譜柱為BEH C18 column（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters，英國），柱溫35℃。采用二元流動相洗脫，流速為0.35 mL·min-1。A相為含0.1%甲酸的水溶液，B相為純甲醇。梯度洗脫方法：0 min，3% B；3 min，8% B；7.5 min，20% B；11 min，20% B；13 min，60% B；14.5 min，60% B；15 min，3% B；19 min，3% B。進樣量5 μL。采用外標法測定兒茶素類化合物、咖啡堿和沒食子酸含量。

1.3.2 代謝組學分析 參考課題組前期已建立的方法[20]，采用UHPLC-Q-TOF/MS進行茶葉代謝組學分析。色譜柱為Zorbax Eclipse Plus C18 column（150 mm×3.0 mm，1.8 μm，Agilent Tech.，美國），柱溫40℃。采用二元流動相洗脫，流速為0.4 mL·min-1。A相為含0.1%甲酸的水溶液，B相為純甲醇。梯度洗脫方法：0 min，5% B；3 min，10% B；4 min，15% B；7 min，30% B；16 min，50% B；20 min，95% B；22 min，95% B；22.5 min，5% B；26 min，5% B。進樣量4 μL。質譜采用雙射流電噴霧離子源，正離子模式掃描；毛細管電壓為4 000 V；干燥氣溫度325℃，流速10 L·min-1；霧化氣壓強40 psi；鞘氣溫度325℃，流速11 L·min-1；質譜掃描范圍為m/z 100—1 000。

1.3.3 總黃酮和黃酮（醇）糖苷組分含量測定 采用三氯化鋁法測定總黃酮含量，參照陳勤操等[15]的方法，稍有改動：0.3 g茶樣使用25 mL的95%乙醇提取后，4 000 r/min離心10 min，吸取0.5 mL上清液于25 mL比色管中，加入1 mL的10% AlCl3溶液和4 mL pH 5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，定容至25 mL，搖勻反應30 min，于415 nm波長下用10 mm比色皿測定吸光度。

采用UHPLC-Q-Orbitrap-MS測定黃酮（醇）糖苷組分含量。色譜柱為HSS T3 column（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Waters，英國），柱溫40℃。采用二元流動相洗脫，流速為0.4 mL·min-1。A相為含0.1%甲酸的水溶液，B相為含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯度洗脫方法：0 min，2% B；0.5 min，2% B；10 min，15% B；18 min，40% B；20 min，90% B；20.9 min，90% B；21 min，2% B；25 min，2% B。進樣量3 μL。質譜使用電噴霧離子化（ESI），在正離子模式下掃描；噴霧電壓3.5 kV；離子傳輸管溫度300℃；S-lens RF水平50；鞘氣流速45 L·min-1；輔助氣加熱溫度350℃，流速10 L·min-1；質譜掃描范圍為m/z 80—1 200。采用外標法對烏龍茶中黃酮（醇）糖苷組分含量進行定量。

1.4 數據處理

UHPLC-Q-TOF/MS得到的原始譜圖使用Profinder B.08.00 software和Mass Profiler Professional software 13.0（Agilent Tech.，Santa Clara，美國）分別進行峰提取和峰匹配。主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）使用Simca 14.1（Umetrics AB，Ume?，瑞典）。獨立樣本T檢驗和非參數檢驗（Kruskal- Wallis H test）使用IBM SPSS Statistics software 25（美國），<0.05認為有顯著差異。UHPLC-Q-Orbitrap-MS采集的數據使用Xcalibur 4.2（ThermoFisher，美國）進行定性和定量分析。

2 結果

2.1 ‘永春佛手’‘鐵觀音’和‘水仙’品種烏龍茶中主要生化成分差異

2.1.1 游離氨基酸組分差異 清香型烏龍茶中，‘永春佛手’的天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸含量顯著高于‘鐵觀音’，僅-氨基丁酸含量同時高于‘鐵觀音’和‘水仙’，分別是‘鐵觀音’‘水仙’烏龍茶的3.75倍和2倍；‘永春佛手’品種的茶氨酸含量（7.66 mg?g-1）和氨基酸總量（13.82 mg·g-1）均高于‘鐵觀音’（4.96 mg·g-1、9.70 mg·g-1）和‘水仙’（5.45 mg·g-1、12.29 mg·g-1），但無統計學差異。濃香型‘永春佛手’對比濃香型‘鐵觀音’，其天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、纈氨酸、酪氨酸、精氨酸含量較高，氨基酸總量在‘永春佛手’中含量較高但無統計學差異；濃香型‘水仙’烏龍茶多個氨基酸組分與氨基酸總量顯著低于‘永春佛手’烏龍茶。在陳香型烏龍茶中，‘永春佛手’的茶氨酸含量顯著高于‘鐵觀音’和‘水仙’，含量是兩個對照品種的2—3倍；天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸和酪氨酸均在陳香型‘永春佛手’中含量最高，其氨基酸總量達到‘鐵觀音’和‘水仙’品種的2倍。

2.1.2 兒茶素組分、咖啡堿和沒食子酸含量差異 3種香型的‘永春佛手’與對照品種之間兒茶素組分含量具有顯著差異（表2）。清香型烏龍茶中，表兒茶素（EC）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、兒茶素沒食子酸酯（CG）在‘永春佛手’中的含量顯著高于‘鐵觀音’和‘水仙’，表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）在兩個對照品種中的含量均高于‘永春佛手’烏龍茶，兒茶素總量在三者中無統計學顯著差異。濃香型烏龍茶中，僅CG在‘永春佛手’中含量同時高于‘鐵觀音’和‘水仙’；在兒茶素總量上，‘永春佛手’（134.64 mg·g-1）高于‘水仙’（78.37 mg·g-1），與‘鐵觀音’（140.82 mg·g-1）無顯著差異。陳香型烏龍茶中，酯型兒茶素（表兒茶素沒食子酸酯ECG、CG、EGCG、GCG）總量和非酯型兒茶素（EC、兒茶素C、表沒食子兒茶素EGC、沒食子兒茶素GC）總量均在‘永春佛手’烏龍茶中含量最高，‘永春佛手’烏龍茶的兒茶素總量（103.13 mg·g-1）分別是‘鐵觀音’和‘水仙’烏龍茶的1.47和1.58倍。‘永春佛手’烏龍茶的咖啡堿含量在清香型和濃香型烏龍茶中與對照品種無統計學差異，在陳香型烏龍茶中呈現較高含量。與對照品種相比，3種香型烏龍茶中沒食子酸在‘永春佛手’烏龍茶中的含量均高于‘鐵觀音’，低于‘水仙’品種。

表1 不同品種制成的3種香型烏龍茶氨基酸含量

數據為平均值±標準差（清香型和濃香型‘永春佛手’茶：n=18；其他茶樣：n=3）；不同小寫字母表示‘永春佛手’與相同香型的對照品種（‘鐵觀音’和‘水仙’）間差異顯著（<0.05，Duncan’s test）。下同

The data are mean value ± SD (Fresh-scent and strong-scent YCFS: n=18; others: n=3). Different letters indicate that there is significant difference between YCFS and the control cultivars (TGY and SX) of same scent type (＜0.05, Duncan’s test). The same as below

2.2 烏龍茶代謝組學分析

進一步利用UHPLC-Q-TOF/MS對3種香型的‘永春佛手’‘鐵觀音’和‘水仙’烏龍茶進行代謝組學分析。檢測的數據經過峰提取和匹配后，共得到3 311個化合物特征離子。根據上述化合物特征離子，在Simca 14.1軟件中對不同類型茶樣進行主成分分析（PCA）（圖1-A）。PCA圖可以初步了解不同樣品間的總體化合物差異和重復樣品的組內變異度大小，從圖1-A可以看出同一香型的不同品種烏龍茶得到較好區分，說明不同品種茶樹制成的烏龍茶具有明顯的化合物差異。濃香型‘永春佛手’烏龍茶的組內變異度大于清香型‘永春佛手’烏龍茶；平行重復的3個樣品組內變異度均較小。

對以上的特征離子進行化合物鑒定和差異化合物分析。根據課題組前期代謝組學分析和化合物鑒定方面的結果[16,22-25]，本研究共鑒定出159個化合物，包括10個生物堿、12個氨基酸、5個香氣前體、14個二聚兒茶素、7個黃酮生物堿、12個黃烷醇、31個黃酮（醇）糖苷、40個脂類、6個有機酸、14個酚酸和8個其他物質。以清香型、濃香型和陳香型烏龍茶為分類對其進行PLS-DA分析，根據變量重要性投影（variable importance in project，VIP）大于1和具有統計學顯著差異（Kruskal-Wallis H test，<0.05）的化合物進行篩選，最后清香型、濃香型和陳香型烏龍茶分別保留了50、59、47個差異化合物。對3種香型的差異化合物進行韋恩圖分析（如圖1-B所示），其中23個化合物在3種香型中均具有顯著性差異，對其進行分類，其中差異個數最多的化合物是黃酮（醇）糖苷類，共有14個，分別為4個芹菜素糖苷（芹菜素6, 8-C-二葡萄糖苷、芹菜素6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷、異牡荊素、牡荊素）、4個槲皮素糖苷（槲皮素3-O-（3-p-香豆酰葡萄糖苷）、槲皮素3-O-葡萄糖酰蕓香糖苷、槲皮素3-O-半乳糖苷、槲皮素3-O-葡萄糖苷）、4個山柰酚糖苷（2''-O-反式-對香豆酰紫云英苷、山柰酚3-O-葡萄糖酰蕓香糖苷、山柰酚3-O-葡萄糖苷、山柰酚3-O-蕓香糖苷）和2個楊梅素糖苷（楊梅素3-O-半乳糖苷、楊梅素3-O-葡萄糖苷）。

表2 不同品種制成的3種香型烏龍茶兒茶素、咖啡堿和沒食子酸含量

A：永春佛手、鐵觀音、水仙3種香型烏龍茶的主成分分析得分圖（R2X=0.337，Q2=0.286）（圓點表示永春佛手烏龍茶、正方形表示鐵觀音烏龍茶、三角形表示水仙烏龍茶；紅色表示清香型烏龍茶、藍色表示濃香型烏龍茶、綠色表示陳香型烏龍茶）；B：3個品種制成的3種香型烏龍茶差異化合物分析

對3個品種制成的清香型、濃香型和陳香型烏龍茶中的差異化合物峰面積數據歸一化后進行熱圖分析，如圖2所示。圖2-A顯示清香型烏龍茶中，具有差異的黃酮醇糖苷類化合物共有19個，其中除了山柰苷（kaempferitrin）在‘鐵觀音’和‘水仙’品種中的含量較高外，其他黃酮（醇）糖苷類化合物均在‘永春佛手’烏龍茶中的含量最高，包括上述14個在3種香型中同時具有差異的黃酮（醇）糖苷和槲皮素3-O-蕓香糖苷（quercetin 3-O-rutinoside）、槲皮素二葡萄糖苷（quercetin 3, 4-O-diglucoside）、槲皮素3-O-半乳糖酰蕓香糖苷（quercetin 3-O-galactosylrutinoside）、槲皮素3-O-（3-對香豆酰葡萄糖苷）（quercetin 3-O-（3-p- coumaroylglucoside））。近年來在年份茶中逐漸成為研究熱門的黃酮生物堿（flavonoid alkaloids）[20,26-29]在清香型烏龍茶中檢測到7個EPSF（N-ethyl-2- pyrrolidinone- substituted flavan-3-ols）組分，且均在‘水仙’品種中呈現較高含量。在清香型烏龍茶差異化合物的3個生物堿中，除磷酸膽堿（phosphocholine）在‘永春佛手’和‘水仙’中的含量較高外，膽堿（choline）和甘油磷酰膽堿（glycerophosphocholine）在‘永春佛手’中的平均含量高于兩個對照品種。

圖2-B顯示濃香型‘永春佛手’品種內差異比較大，這可能是由于所采集的樣品原料不同造成的影響。在濃香型烏龍茶中，脂類在‘永春佛手’品種中的平均含量較高，包括亞油酰基乙醇酰胺（linoleoyl ethanolamide）、磷脂酰乙醇胺（PE）、甘油二酯（DG）和多種溶血磷脂酰膽堿（LysoPC）。具有統計學差異的黃酮（醇）糖苷類在濃香型烏龍茶中共有20個，其中山柰苷在濃香型‘鐵觀音’中呈現較高含量，其余19個黃酮（醇）糖苷組分均在濃香型‘永春佛手’中的含量較高，包括芹菜素 6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷、山柰酚 3-O-半乳糖苷、山柰酚 3-O-香豆酰葡萄糖苷、槲皮素 3-O-蕓香糖苷、山柰酚 3-O-半乳糖酰蕓香糖苷和14個3種香型同時具有差異的黃酮（醇）糖苷。二聚兒茶素（原花青素B1、原花青素B2、原花青素B3、原花青素C1、表兒茶素-4-8-表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素-4-8-表兒茶素沒食子酸酯）在‘永春佛手’烏龍茶中的含量均高于兩個對照品種。兒茶素組分中EGCG、EGC和EC在濃香型‘永春佛手’烏龍茶中的含量與‘鐵觀音’烏龍茶差異不明顯，高于濃香型‘水仙’中的含量；‘永春佛手’中兒茶素C的平均含量高于‘鐵觀音’和‘水仙’品種，以上結果與上述超高效液相色譜測定的兒茶素絕對定量結果一致。4個在濃香型烏龍茶中具有顯著差異的生物堿類化合物（膽堿、磷酸膽堿、甘油磷酰膽堿、5'-甲基硫腺苷）均以‘永春佛手’中的含量最高。

圖2-C顯示在陳香型烏龍茶中，具有差異的18個黃酮（醇）糖苷，包括5個芹菜素糖苷（芹菜素6,8-C-二葡萄糖苷、芹菜素6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷、芹菜素6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷、異牡荊素、牡荊素）、5個山柰酚糖苷（2''-O-反式-對香豆酰紫云英苷、山柰酚3-O-葡萄糖酰蕓香糖苷、山柰酚3-O-半乳糖苷、山柰酚3-O-葡萄糖苷、山柰酚3-O-蕓香糖苷）、6個槲皮素糖苷（槲皮素3-O-（3-p-香豆酰葡萄糖苷）、槲皮素3-O-葡萄糖酰蕓香糖苷、槲皮素3-O-半乳糖酰蕓香糖苷、槲皮素3，4'-O-二葡萄糖糖苷、槲皮素3-O-葡萄糖苷、槲皮素3-O-半乳糖苷）、2個楊梅素糖苷（楊梅素3-O-半乳糖苷、楊梅素3-O-葡萄糖苷），均在‘永春佛手’中含量最高。在陳香型烏龍茶中具有顯著差異的生物堿類化合物有2個，為甘油磷酰膽堿和可可堿（theobromine），與其他香型烏龍茶中生物堿的結果相似，均為‘永春佛手’中的含量較高，說明生物堿也可能是‘永春佛手’茶與對照品種的關鍵差異化合物。熱圖中顯示兒茶素組分EC、ECG、EGCG在‘永春佛手’烏龍茶中呈現較高含量，GCG、GC在‘水仙’品種中含量較高，與超高效液相色譜定量結果一致。4個二聚兒茶素類化合物（表兒茶素-4-8-表兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素-4-8-表沒食子兒茶素、原花青素B1、原花青素B2）在‘永春佛手’烏龍茶中的含量高于‘鐵觀音’和‘水仙’烏龍茶。

從上述3種香型烏龍茶的代謝組學差異化合物比較中可以發現，EPSF是清香型‘水仙’烏龍茶中相對于其他兩種清香型烏龍茶含量較高的化合物，脂類在濃香型烏龍茶中差異較大，二聚兒茶素類在濃香型和陳香型烏龍茶中均在‘永春佛手’品種中含量較高，黃酮（醇）糖苷、生物堿類化合物在3種香型中均具有較大差異，且黃酮（醇）糖苷是3種香型中差異種類和數量最多的化合物，絕大部分均以‘永春佛手’品種含量最高，表明黃酮（醇）糖苷可能是3種香型烏龍茶中‘永春佛手’與對照品種（‘鐵觀音’‘水仙’）間的關鍵差異化合物。

2.3 黃酮（醇）糖苷定量分析

為了進一步驗證黃酮（醇）糖苷在3個品種中的差異，對上述3個品種制成的清香型、濃香型和陳香型烏龍茶進行黃酮（醇）糖苷定量分析（表3）。黃酮總量為使用三氯化鋁法測定茶葉中黃酮（醇）含量，由于茶葉中的黃酮（醇）主要以糖苷形式存在，所以總黃酮含量可以一定程度代表茶葉中的總黃酮（醇）糖苷含量。從表4可以看出，比色法檢測得到的總黃酮含量和14個黃酮（醇）糖苷組分，在3種香型的‘永春佛手’烏龍茶中均顯著高于同一香型的‘鐵觀音’和‘水仙’烏龍茶。在3種香型烏龍茶中，由比色法檢測到的‘永春佛手’烏龍茶總黃酮含量比相同香型的對照樣品高約10 mg·g-1。

由3個品種制成的烏龍茶中，槲皮素糖苷的含量均高于芹菜素糖苷、楊梅素糖苷和山柰酚糖苷。3個品種所制烏龍茶的槲皮素、山柰酚和楊梅素單糖苷中，半乳糖苷含量高于葡萄糖苷；而在槲皮素和山柰酚三糖苷中，葡萄糖酰蕓香糖苷的含量高于半乳糖酰蕓香糖苷。異牡荊素在3個品種烏龍茶中的含量均高于牡荊素，同時也是芹菜素糖苷中含量最高的組分。芹菜素糖苷的含量在不同品種的烏龍茶中呈現相同的分布：異牡荊素>芹菜素6, 8-C-二葡萄糖苷>芹菜素6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷≈芹菜素6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷>牡荊素。

3 討論

3.1 主要化學成分對不同品種烏龍茶品質的影響

茶葉中的化學成分是茶湯的物質基礎，經沸水沖泡溶解進入茶湯中，影響茶葉的滋味。經感官審評，3個品種的清香型烏龍茶中，‘永春佛手’茶尚醇厚回甘，‘鐵觀音’具有青味，水仙滋味濃厚。濃香型烏龍茶中，‘永春佛手’和‘鐵觀音’滋味較醇厚，‘水仙’是醇厚回甘。陳香型‘永春佛手’茶則是口感略厚，較苦，‘鐵觀音’和‘水仙’均是較薄，有微微的酸味。同一香型中均是‘水仙’品種的湯色最深，滋味強度最高。氨基酸是茶葉鮮味的主要來源，本研究中，‘永春佛手’烏龍茶同一香型的不同樣本間茶氨酸含量和氨基酸總量差異較大，平均值與對照品種無顯著差異，在審評中不同品種間的鮮爽度無明顯的差異。兒茶素類化合物是茶湯中苦澀味的主要來源[30]，本研究的3個品種烏龍茶中，陳香型烏龍茶的‘永春佛手’樣品與對照品種烏龍茶的兒茶素組分差異最大，兒茶素總量以及6個主要兒茶素組分（EGC、C、EGCG、EC、ECG、CG）均為‘永春佛手’烏龍茶中含量最高，這導致陳香型‘永春佛手’具有比陳香型‘水仙’和‘鐵觀音’更強的苦澀味。3個品種制成的濃香型和陳香型烏龍茶的兒茶素總量均不同程度地低于相應的清香型烏龍茶，兒茶素組分可能在濃香型烏龍茶的“焙火”和陳香型烏龍茶的“貯藏”過程中轉化為其他物質，并使濃香型和陳香型烏龍茶呈現出相對于清香型更加醇和的滋味特征。咖啡堿作為茶葉中重要的滋味貢獻物質，主要呈現苦味，同時與其他多種物質具有互作關系，包括與EGCG混合呈現消隱作用，增強茶氨酸鮮味等[31]，絕對定量結果顯示其僅在陳香型烏龍茶中具有統計學差異，且同一品種的不同香型烏龍茶間無明顯增減變化，說明咖啡堿具有較高穩定性，并在茶湯的滋味貢獻中起到調節作用。沒食子酸在‘水仙’品種制成的3種香型烏龍茶中均呈現最高含量，沒食子酸主要與茶葉中其他物質協調作用，中和苦味與澀味，使茶湯滋味爽快、圓潤，有研究表明沒食子酸能夠在一定程度上增加綠茶的鮮味[32]。

表3 3種香型烏龍茶中總黃酮及其黃酮（醇）糖苷組分定量

*代表該物質采用標準品驗證，quercetin 3-O-galactosylrutinoside和quercetin 3-O-glucosylrutinoside使用quercetin 3-O-rutinoside的標準曲線計算含量，kaempferol 3-O-galactosylrutinoside和kaempferol 3-O-glucosylrutinoside使用kaempferol 3-O-rutinoside的標準曲線計算含量，kaempferol 3-O-glucoside使用kaempferol 3-O-galactoside的標準曲線計算含量，apigenin 6, 8-C-diglucoside、apigenin 6-C-glucoside-8-C-arabinoside、apigenin 6-C-arabinoside-8-C-glucoside使用isovitexin的標準曲線計算含量，myricetin 3-O-galactosylrutinoside、myricetin 3-O-glucosylrutinoside、myricetin 3-O-rutinoside、myricetin 3-O-glucoside使用myricetin 3-O-galactoside的標準曲線計算含量；數據代表平均值±標準差（清香和濃香佛手：n=18；其他n=3,）；a，b，c：不同字母表示‘永春佛手’與相同香型的對照品種（‘鐵觀音’和‘水仙’）比較具有顯著差異（<0.05，Duncan’ test）

* means the compound was verified by standard，quercetin 3-O-galactosylrutinoside and quercetin 3-O-glucosylrutinoside use the standard curve of quercetin 3-O-rutinoside to calculate the content, kaempferol 3-O-galactosylrutinoside and kaempferol 3-O-glucosylrutinoside use the standard curve of kaempferol 3-O-rutinoside to calculate the content, kaempferol 3-O-glucoside uses the standard curve of kaempferol 3-O-galactoside to calculate the content, the standard curve of isovitexin is used to calculate the content of apigenin 6, 8-C-diglucoside, apigenin 6-C-glucoside-8-C-arabinoside and apigenin 6-C-arabinoside-8-C-glucoside, the standard curve of myricetin 3-O-galactoside is used to calculate the content of myricetin 3-O-galactosylrutinoside, myricetin 3-O-glucosylrutinoside, myricetin 3-O-rutinoside and myricetin 3-O-glucoside; The data are mean value ± SD (fresh-scent and strong-scent YCFS: n=18; others: n=3); a , b, c: different letters indicate that there is significant difference between YCFS and the control cultivars (TGY and SX) with the same scent type (＜0.05, Duncan’ test)

EPSF類成分是兒茶素類成分的8-C位或6-C位被N-乙基-2-吡咯烷酮取代形成的一類化合物，近年來相繼在不同種類的茶葉中被發現，特別是在年份茶中具有較高含量，且具有良好生物活性而成為研究熱門[20,26-29]。本研究中3個品種的不同香型烏龍茶均鑒定了7種EPSF成分。在清香型‘水仙’烏龍茶中7種EPSF的含量均比清香型‘永春佛手’和清香型‘鐵觀音’烏龍茶的含量高，在濃香型和陳香型中具有差異的種類減少，但仍然為水仙品種制成的烏龍茶中含量較高，包括濃香型的8-C S-EGCG-cThea，陳香型的8-C R-EC-cThea和8-C S-EGCG-cThea，表明‘水仙’品種的鮮葉在加工過程中可能更容易形成EPSF類成分，導致其含量較高。研究表明高溫烘焙[28]和貯藏[29]會促進兒茶素類成分與茶氨酸發生反應形成EPSF類成分，在濃香型和陳香型烏龍茶中EPSF類成分差異減少，可能原因是EPSF類成分在濃香型烏龍茶的高溫烘焙和陳香型烏龍茶的貯藏過程中含量逐漸增加，導致不同品種間差異減少。烏龍茶中本身具有較多種類和較高含量的二聚兒茶素，但目前其具體的形成途徑和變化規律還未有詳細報道[33]。在清香型烏龍茶中，具有差異的二聚兒茶素只有1個（EC-(4alpha->8) -ECG），經過高溫烘焙的濃香型和貯藏后的陳香型烏龍茶分別有6個（原花青素B1、原花青素B2、原花青素B3、原花青素C1、表兒茶素-4-8-表兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素-4-8-表沒食子兒茶素沒食子酸酯）和4個（表兒茶素-4-8-表兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素-4-8-表沒食子兒茶素、原花青素B1、原花青素B2），除了陳香型烏龍茶中的表兒茶素-4-8-表沒食子兒茶素在‘鐵觀音’和‘水仙’中含量較高外，其他二聚兒茶素均在‘永春佛手’中的含量較高。以上結果表明不同烘焙溫度條件下的兒茶素組分形成了不同的二聚兒茶素類成分，同時在積累的含量上可能具有品種差異性，對不同品種烏龍茶中二聚兒茶素類成分的形成差異有待進一步深入研究。

3.2 高黃酮（醇）糖苷是‘永春佛手’品種的重要化學特征

從代謝組學與黃酮（醇）糖苷定量分析結果可以發現，黃酮（醇）糖苷在‘永春佛手’和對照品種中的含量具有較大差異。進行絕對定量的20個黃酮（醇）糖苷中有14個組分在‘永春佛手’品種制成的清香型、濃香型和陳香型烏龍茶中含量最高，同時其總黃酮（醇）含量顯著高于對照，這與郭雅玲等[1]發現‘永春佛手’中黃酮含量顯著高于其他品種的結果一致。ZHENG等[34]研究發現‘九龍袍’‘浙農902’‘金萱’和‘黃金桂’品種制成的相同茶類中黃酮醇苷總量和組分的差異大于兒茶素總量和組分的差異，說明黃酮（醇）糖苷在其他品種茶樹中同樣具有較大差異，其可作為區分不同茶樹品種所制干茶的關鍵成分。吳春燕[35]使用LC-MS檢測了18個茶樹品種鮮葉中14種黃酮（醇）糖苷含量，其中槲皮素糖苷含量均最高，與本研究結果一致。黃酮（醇）糖苷是茶湯的重要呈味物質，具有較低的滋味閾值，對茶湯的澀味具有重要貢獻[36]，但在上述審評結果中，‘永春佛手’茶澀味并不突出，可能是由于其他滋味物質協同作用下澀味降低。黃酮（醇）糖苷具有廣泛的生物活性，如文獻報道山柰酚能夠保護胰腺細胞的生存從而起到抗糖尿病的作用[37]，山柰酚和槲皮素可以有效誘導口腔癌細胞的凋亡起到抗癌作用[38]，以及具有抗炎[39]、調節人體代謝[40]等功效。因此，有望將‘永春佛手’品種作為黃酮（醇）糖苷特異性積累的茶樹種質資源，對其中高含量的黃酮（醇）糖苷組分進行深度開發，應用于食品保健領域。

4 結論

相比于對照品種‘鐵觀音’和‘水仙’，‘永春佛手’品種制作的陳香型烏龍茶中茶氨酸含量、氨基酸總量、兒茶素總量均顯著高于對照品種，‘永春佛手’品種制作的清香型和濃香型烏龍茶也具有較高的茶氨酸和氨基酸總量，但無統計學差異。采用色譜-質譜聯用技術對以上樣品進行代謝組學分析，發現清香型、濃香型、陳香型‘永春佛手’烏龍茶與相同香型的對照品種烏龍茶間分別有50種、59種、47種差異化合物，主要為生物堿、氨基酸、香氣前體、EPSF、黃烷醇、黃酮（醇）糖苷、脂類等化合物；化合物絕對定量結果顯示14個黃酮（醇）糖苷組分在‘永春佛手’茶中含量最高。具有較高含量的黃酮（醇）糖苷類化合物是‘永春佛手’烏龍茶最為顯著的特征。

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Study on the Chemical Constituents of Yongchun Foshou Oolong Tea Based on Metabolomics

1Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Tea Biology and Resource Utilization of Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008;2Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;3Yongchun Agricultural and Rural Bureau, Quanzhou 362600, Fujian;4Agilent Technologies (China) Co., Ltd., Beijing 100102

【】 Oolong teas made with different tea cultivars have a great difference in flavor and chemical components. In this study, non-targeted metabolomics, absolute quantitative analysis, and multivariate statistics analysis were used to investigate the chemical differences among Yongchun Foshou (YCFS), Tieguanyin (TGY) and Shuixian (SX) oolong tea and to screen characteristic chemical components of YCFS oolong tea, as well as to study the influence of tea cultivars on chemical components and sensory quality of oolong tea. 【】cv. Foshou was used as the main research sample andcv. Tieguanyin andcv. Shuixian were used as the controls. Three tea cultivars were manufactured into fresh-scent, strong-scent and aged-scent oolong teas. Ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry (UHPLC-Q-TOF/MS) was used for non-targeted metabolomics analysis to screen differential compounds in the oolong teas made from different cultivars. In addition, ultra-high performance liquid chromatograph, amino acid analyzer and ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-orbitrap-mass spectrometry (UHPLC-Q-Orbitrap-MS) was applied for absolute quantifications of main chemical constituents and differential compounds in oolong teas made from different tea cultivars. 【】 Compared with the control oolong teas of same scent type, YCFS oolong tea had relatively higher contents in total amino acid and theanine. The contents of total catechins and caffeine were not significantly different among the 3 cultivars in fresh-scent and strong-scent oolong teas, which were the highest in YCFS in aged-scent oolong teas. The content of gallic acid was SX>YCFS>TGY in 3 scent types oolong teas. Metabolomics analysis combined with multivariate statistics analysis showed that the compound patterns in oolong teas made from different tea cultivars were significantly different. In fresh-scent, strong-scent and aged-scent oolong teas, there were 50, 59 and 47 differential compounds between YCFS and control cultivar, respectively. Among them, 23 differential compounds were common, including 14 flavone (flavonol) glycosides, 5 catechins and their derivatives, 1 lipid, 1 alkaloid, 1 organic acid and 1 amino acid. Further quantitative analysis of 20 main flavone (flavonol) glycosides showed that the contents of 14 flavone (flavonol) glycosides were the highest in YCFS oolong teas, whose contents were 1.4 to 14.6-fold of that in TGY oolong teas and were 1.3 to 18.0-fold of that in SX oolong teas. Among four kinds of flavone (flavonol) glycosides, quercetin glycosides were the main flavone (flavonol) glycosides with higher contents than glycosides of kaempferol, myricetin and apigenin. Sensory evaluation combined with chemical composition results showed that the higher contents of flavone (flavonol) glycosides did not significantly enhance the astringency of YCFS oolong tea infusions. 【】 The metabolomics method effectively characterized the component differences in oolong teas made from different tea cultivars in this study. There were obvious differences in compound patterns among YCFS, TGY and SX oolong teas. Flavone (flavonol) glycosides were the most significantly differential compounds. The higher content of flavone (flavonol) glycosides was a major chemical feature of YCFS oolong tea and was expected to be used as a discriminant index for the identification of oolong tea cultivar in the future.

oolong tea; cultivar-characteristic components; metabolomics; LC-MS; flavone (flavonol) glycoside

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.04.012

2021-04-07；

2021-07-01

國家自然科學基金（31972467）、國家現代農業產業技術體系資助（CARS-19）

彭佳堃，E-mail：pengjiakun@tricaas.com。通信作者林智，E-mail：linzhi@caas.cn。通信作者戴偉東，E-mail：daiweidong@tricaas.com

（責任編輯 趙伶俐）