GC-MS法同時(shí)測(cè)定復(fù)方牙痛寧搽劑中薄荷腦和冰片的含量

盧秋桃 ，胡燕梨，張金禮

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州510400)

復(fù)方牙痛寧搽劑是由松花粉、丁香、薄荷腦、花椒、冰片和茵陳等藥味加輔料麻油制成的搽劑，具有消腫、消炎和止痛的功效。方中冰片和薄荷腦均有清熱抗炎、消腫止痛的作用[2-6]，兩者均為方中君藥，且與該藥效一致。原標(biāo)準(zhǔn)收載于國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編口腔腫瘤兒科分冊(cè)[1]中，僅有薄荷腦的鑒別項(xiàng)目，無含量測(cè)定控制項(xiàng)目。冰片是由龍腦和其在合成過程中產(chǎn)生的異龍腦兩種同分異構(gòu)體組成的，目前對(duì)于冰片和薄荷腦的測(cè)定主要采用氣相色譜法[7-10]。由于復(fù)方牙痛寧搽劑處方中含揮發(fā)性成分較多，基質(zhì)干擾較大，而氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GS-MS)聯(lián)用儀是一種靈敏度高、選擇性好的儀器，測(cè)定中成藥中揮發(fā)性成分具有較大優(yōu)勢(shì)，因此本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)[11-15]報(bào)道建立GS-MS法同時(shí)測(cè)定復(fù)方牙痛寧搽劑中薄荷腦和冰片的含量，為其質(zhì)量控制提供參考，同時(shí)也為進(jìn)一步提高復(fù)發(fā)牙痛寧搽劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

ShimadzuTQ8040氣相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津儀器公司)；GC-MS實(shí)時(shí)分析，GC-MS再解析工作站；氣質(zhì)專用色譜柱SH-Rxi-5Sil MS(0.25 mm×30 m，0.25 μm)(日本島津儀器公司)；XP204E型電子天平(瑞士梅特勒)；KG-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。復(fù)方牙痛寧搽劑(西安必康嘉隆制藥有限公司，批號(hào)181101、190601、191201，每瓶5 mL)。對(duì)照品：龍腦(批號(hào)：110881-201709，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以99.6%計(jì))、異龍腦(批號(hào)：111512-201603，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以96.7%計(jì))、薄荷腦(批號(hào)：110718-201707，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以99.8%計(jì))，儲(chǔ)存溫度2～10 ℃，對(duì)照品均購于中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定使用；正己烷為色譜級(jí)(美國(guó)Fisher公司)；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：SH-Rxi-5Sil MS(30 m ×0.25 mm，0.25 μm)，分流進(jìn)樣；分流比20∶1，進(jìn)樣口溫度300 ℃，柱箱初始溫度70 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升溫至300 ℃，保持5 min。載氣：高純氦氣，柱流量1 mL·min-1，進(jìn)樣量1 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃，溶劑延遲時(shí)間2 min，電離方式：EI，電子能量70 eV，掃描方式Q3Scan，質(zhì)量掃描范圍：45～500 amu，檢測(cè)器電壓0.2 kV，采用Q3全掃描方式獲得對(duì)照混合溶液的TIC圖，從而確定各成分的保留時(shí)間和特征離子，然后采用SIM掃描方式進(jìn)行定量，龍腦、異龍腦和薄荷腦的定量離子分別為m/z95、71。在上述色譜和質(zhì)譜的條件下，混合對(duì)照品、供試品及陰性樣品的總離子流見圖1，利用供試品溶液的TIC圖，分別對(duì)各峰進(jìn)行質(zhì)譜掃描，并采用儀器提供的NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫進(jìn)行檢索，并與文獻(xiàn)報(bào)道[11，15]進(jìn)行比較。異龍腦、龍腦和薄荷腦的質(zhì)譜見圖2。

注：1.薄荷腦；2.異龍腦；3.龍腦。

圖2 異龍腦、龍腦和薄荷腦的特征離子碎片

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取龍腦對(duì)照品10.26 mg，異龍腦對(duì)照品12.18 mg，薄荷腦對(duì)照品8.06 mg置同一10 mL量瓶中，加正己烷溶解稀釋至刻度，作為5號(hào)混合對(duì)照品溶液(每1 mL含龍腦1.021 9 mg，異龍腦1.177 8 mg，薄荷腦0.804 4 mg)。

2.3 供試品溶液制備

取本品10瓶，混勻，精密吸取2 mL置錐形瓶中，精密加入正己烷25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲10 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用正己烷補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用?0.22 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 陰性樣品制備

按照復(fù)方牙痛寧搽劑的處方工藝和處方量的1/10，分別取缺冰片和薄荷腦的的樣品作為模擬冰片陰性樣品，模擬薄荷腦陰性樣品。

2.5 專屬性實(shí)驗(yàn)

分別取上述對(duì)照品、供試品和缺冰片的陰性樣品及缺薄荷腦的陰性樣品，按照“2.1”下方法進(jìn)行測(cè)定，記錄總離子流圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陰性樣品對(duì)冰片和薄荷腦的測(cè)定無干擾。

2.6 線性關(guān)系考察

分別精密吸取 “2.2”項(xiàng)下的5號(hào)混合對(duì)照品溶液100 μL、500 μL、1 mL、2 mL分別置10 mL量瓶中，依次作為1-4號(hào)對(duì)照品混合溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別以定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以進(jìn)樣量的質(zhì)量(ng)為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線性回歸，測(cè)定結(jié)果見表1、表2、表3、表4。

表1 龍腦標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果

表2 異龍腦標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果

表3 薄荷腦標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果

表4 龍腦、異龍腦及冰片的線性方程相關(guān)系數(shù)及線性范圍

2.7 精密度試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針，進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，供試品溶液中定量離子龍腦峰面積的RSD為0.71%，異龍腦峰面積的RSD為0.74%，薄荷腦峰面積的RSD為1.05%，且都小于3%，說明該方法精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液，分別在0，1，2，4，8，12，16，20，24 h進(jìn)行測(cè)定，記錄各色譜峰面積，結(jié)果龍腦、異龍腦和薄荷腦峰面積的RSD分別為2.81%、2.24%和1.96%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)181101的牙痛寧搽劑樣品6份，然后分別按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果龍腦、異龍腦及薄荷腦的含量分別為10.02、18.54和7.85 mg/mL，RSD值分別為1.21%、2.06%、0.98%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量同一批號(hào)181101的牙痛寧搽劑樣品1 mL，共制備6份，然后分別精密稱取龍腦約10 mg、異龍腦18 mg和薄荷腦7.8 mg，各6份，分別加入上述6份供試品溶液中，然后按照“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，按照“2.1”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件的方法進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算龍腦、異龍腦和薄荷腦的平均回收率。結(jié)果見表5。

表5 回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.11 樣品含量測(cè)定

取不同批號(hào)的3批復(fù)方牙痛寧搽劑，按照“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，每批樣品平行制備2份，按照“2.1”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，以外標(biāo)法分別計(jì)算3批樣品中龍腦、異龍腦和薄荷腦的含量，測(cè)得結(jié)果見表6。

表6 復(fù)方牙痛寧搽劑樣品含量測(cè)定結(jié)果 (n=2，mg/mL)

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇

冰片主要分為天然冰片和合成冰片，天然冰片具有清熱止痛、治療咽喉腫痛的作用；合成冰片主要是采用樟腦、松節(jié)油、α-蒎烯等原料進(jìn)行合成，在合成過程中會(huì)產(chǎn)生或殘留一些樟腦等雜質(zhì)。樟腦內(nèi)服時(shí)會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定的毒副作用[16]，薄荷腦是唇形科植物薄荷全草提煉出來的結(jié)晶，具有特殊清涼的薄荷香氣，內(nèi)服可以治療牙痛、咽喉等炎癥，具有清涼止癢的作用。冰片與薄荷腦二者于本品的藥理作用一致。GC-MS儀具有分析速度快、靈敏度高、選擇性高的優(yōu)點(diǎn)，可以用于揮發(fā)性成分的分析，因此本實(shí)驗(yàn)選擇冰片和薄荷腦作為復(fù)方牙痛寧搽劑中主要測(cè)定指標(biāo)成分。

3.2 供試品制備及色譜條件選擇

本實(shí)驗(yàn)分別考察了無水乙醇、正己烷、乙酸乙酯和甲醇分別作為供試品的提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正己烷提取效率高于其他溶劑，且總離子流圖峰形較好，因此選擇正己烷作為提取溶劑。接著考察了氣相色譜條件，由于樣品是中成藥，基質(zhì)復(fù)雜，因此選擇程序升溫方式進(jìn)行考察，同時(shí)盡可能使樣品在較短時(shí)間內(nèi)出峰，因此當(dāng)采用上述色譜條件時(shí)，分離效果較好，同時(shí)對(duì)離子源溫度200 ℃、230 ℃，接口溫度230 ℃、250 ℃進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其影響不大，因此為了保護(hù)離子源和接口，故選擇較低溫度作為實(shí)驗(yàn)所需溫度。

3.3 系統(tǒng)耐用性

實(shí)驗(yàn)分別采用Agilent HP-5 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)、Agilent PEG-20M MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)和島津SH-Rxi-5Sil MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)3個(gè)色譜柱進(jìn)行測(cè)定，并考察了不同載氣流速、不同進(jìn)樣口溫度、不同分流比、不同檢測(cè)器溫度等因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)上述條件在微小范圍內(nèi)變動(dòng)時(shí)，均不影響冰片和薄荷腦的含量測(cè)定，因此本文方法系統(tǒng)耐用性符合要求。

4 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)通過建立GC-MS法同時(shí)測(cè)定復(fù)方牙痛寧搽劑中龍腦、異龍腦和薄荷腦的含量，具有分析速度快、選擇性好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，比目前采用氣相色譜分析具有節(jié)省時(shí)間、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，該方法經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證可以用于復(fù)方牙痛寧搽劑的質(zhì)量控制，比目前標(biāo)準(zhǔn)中單一測(cè)定冰片的含量更加全面，可為改進(jìn)和提高復(fù)方牙痛寧搽劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。