桃紅四物湯對肺纖維化大鼠血清炎癥因子的影響

周 勇，范伏元，柳玉佳，李 妲

(1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208 2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007)

肺纖維化(Pulmonary fibrosis，PF)是以肺泡間質炎癥細胞浸潤、纖維母細胞增生和肺泡間質纖維結締組織沉積為特征的免疫介導的慢性進展性疾病[1]。該病預后不佳，生存率低，中位生存期為2～3年，我國肺纖維化的5年生存率大約為30%，嚴重威脅人類健康[2]。目前，肺纖維化的發病機制尚不完全清楚，但炎癥反應與之聯系緊密[3]。西醫治療肺纖維化的手段有限，長期應用糖皮質激素和免疫抑制劑的副作用較大。因此，尋找治療PF的新思路意義重大。桃紅四物湯是中醫經典名方，源自《醫宗金鑒》，具有養血、活血祛瘀之效，廣泛應用于冠心病、腦梗死、糖尿病、關節炎等疾病的治療[4]。臨床研究表明，桃紅四物湯可以抑制血清中的炎癥因子，從而達到治療相關疾病的效果[5-6]。本次研究提出假設，桃紅四物湯可能通過降低模型大鼠炎癥因子表達，從而起到治療肺纖維化的作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF級SD雌性大鼠50只，體質量(200±20)g，由湖南中醫藥大學實驗動物中心統一代購，動物供應商編碼：GYS-201905230001，質量合格編號：ZS-202011170012，倫理審核編號：LLBH-202010150003，飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心SPF清潔級動物實驗室。

1.1.2 實驗藥物 甲潑尼龍片劑(天津天藥藥物股份有限公司，國藥準字：H20020224)，桃紅四物湯組成：當歸、熟地、川芎、白芍、桃仁各10 g，紅花6 g。各藥物均選用湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房藥材。先取各藥加水適量，花、葉、細莖類質地較疏松和輕浮的植物藥一般浸泡20～30 min后入煎，根、果實類藥物需浸泡60 min后入煎。第一遍煎煮時水量應為藥材量的5～8倍。煎藥一般先用大火煮沸后，再用文火煮，本次實驗煎2次。第1次煎制結束后，將藥汁濾出，重新加水至高出藥平面約0.5～1 cm，進行第2次煎制。

1.1.3 實驗材料 博來霉素(北京索萊寶科技有限公司，貨號：Z8020)，多聚甲醛(Biosharp生物公司，貨號：2275)，水合氯醛(天津市科密歐化學試劑有限公司)；臺式高速離心機(塞維爾servicebio生物科技有限公司D1008E)，大鼠IL-1β、IL-6、TNF-αELISA檢測試劑盒(美國AndyGene公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備 采用氣管內滴注博來霉素制備PF模型，腹腔注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉大鼠，后將其固定，使大鼠的頭部與桌面呈約30°夾角，剃頸毛，消毒頸部皮膚，嚴格無菌操作下，用外科手術刀在頸中作長約1 cm切口，充分分離并暴露氣管，直視下將裝有博來霉素(4 mg/kg)的1 mL注射器針頭穿刺兩環狀軟骨間的氣道中，快速將藥物推入氣管中，期間保持針頭穩定在氣管中央，退針后將鼠板與桌面呈90°夾角，來回旋轉鼠板，盡可能使博來霉素均勻分布在雙肺中。再用手術線縫合傷口，待大鼠麻醉醒后置于鼠盒，放回籠位飼養。對照組采用上述方法給予等體積生理鹽水[7]。

1.2.2 動物分組及給藥方式 50只大鼠適應性喂養1 d后隨機分成5組，每組10只：Ⅰ空白組、Ⅱ模型組、Ⅲ甲潑尼龍組、Ⅳ桃紅四物湯低劑量組、Ⅴ桃紅四物湯高劑量組。灌胃給藥，從造模24 h后起，每天1次，連續灌胃28 d，直到取材。參照人體與動物體表面積的折算系數[8]，將給藥量按標準體重換算成大鼠的每日用藥劑量，將甲潑尼龍片劑制備成0.2 g/L的混懸液，中藥湯劑熬制成低劑量為2 g/mL，高劑量為4 g/mL的水煎劑；Ⅲ組給藥劑量為1.8 mg /( kg·d)，Ⅳ組給藥劑量為2 g /( kg·d)，Ⅴ組給藥劑量為4 g /( kg·d)?？瞻捉M、模型組給予等體積0.9%氯化鈉注射液。

1.3 觀察指標及檢驗方法

連續給藥28 d后，用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，室溫靜置30 min后離心(4 500 r·min-1，5 min，4 ℃)，分離血清，嚴格按照ELISA試劑盒說明書方法檢測血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量。取大鼠左側肺組織以4%多聚甲醛固定，采用蘇木素-伊紅(HE)染色，在光鏡下觀察肺組織肺泡炎癥和纖維化程度。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 病理組織觀察

大鼠肺組織的HE染色結果如圖1顯示，空白組大鼠肺組織結構正常，肺泡腔明顯，肺泡壁薄，肺組織未見明顯充血水腫，未見炎癥細胞浸潤。模型組大鼠肺泡腔縮小，肺泡壁明顯增厚增寬，可見大量炎癥細胞浸潤，部分細支氣管上皮細胞脫落。甲潑尼龍組及桃紅四物湯低、高劑量組肺組織與模型組相比較，肺泡壁變薄，可見局部充血，少量炎癥細胞浸潤，其中甲潑尼龍組和高劑量桃紅四物湯組的纖維化程度更低。見圖1。

圖1 各組肺組織HE染色觀察(×200倍)

2.2 各組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較

與空白組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，甲潑尼龍組、桃紅四物湯低、高劑量組血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α顯著降低(P<0.05)。其中，甲潑尼龍組與桃紅四物湯高劑量比較IL-1β、IL-6、TNF-α差異不具有顯著性(P>0.05)，甲潑尼龍組與桃紅四物湯低劑量比較IL-1β、IL-6、TNF-α差異具有顯著性(P<0.05)，桃紅四物湯劑低劑量組與桃紅四物湯高劑量組之間IL-1β、IL-6、TNF-α差異不具有顯著差異性(P>0.05)。見表1。

表1 5組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量

3 討論

肺纖維化屬于中醫學“肺痹”和“肺痿”等范疇，《素問·痹論篇》記載：“肺痹者，煩滿而喘”，《素問·五臟生成》提出：“有積氣在胸中，喘而虛，名曰肺痹。”《金匱要略》將肺痿單獨列為專篇論述，指出：“痿者萎也，如草木之萎而不榮?！逼洳∫虿C復雜，中醫認為氣虛、痰阻、瘀血是主要病理因素，早期肺脾氣虛為主，外邪侵襲肺及脈絡，致痰瘀互結，病程延綿，在治法上主張清熱化痰治標的同時，也注重活血化瘀以治本[9]。有醫家認為，血瘀貫穿于肺纖維化的全過程，活血化瘀法貫穿于肺纖維化治療之始終[10]。桃紅四物湯是在四物湯的基礎上加入活血化瘀的桃仁、紅花，使其在調補氣血的同時，活血化瘀的功效更佳。

肺纖維化的病理特征為早期肺泡上皮細胞的彌漫性損傷，引起肺泡炎癥，當肺部炎癥持續存在，而免疫相關因子通過轉導途徑擴大肺組織的損傷，導致大量成纖維細胞聚集，驅動膠原、ECM沉積和組織收縮，引起肺實質增厚及瘢痕形成[11]。TNF-α是一種重要的炎癥介質，有聚集炎癥細胞的作用，肺損傷早期增加的TNF-α可上調黏附分子和化學趨化分子，是損傷肺炎癥細胞浸潤的原因，TNF-α也是一種致纖維化因子，可刺激成纖維細胞的增值；IL-1β、IL-6 是重要的促炎因子，主要功能是通過趨化炎癥細胞聚集和促進炎細胞浸潤，加速肺纖維化早期的肺泡炎癥反應，進而介導特發性肺纖維化的發生[12]?，F代研究證實，桃紅四物湯可通過提高抗氧化能力，降低過氧反應等對CCl4誘導的肝纖維化起到保護作用[13]，且具有抑制TNF-α和IL-6的失控性釋放，清除炎癥介質，減少炎癥滲出，促進炎癥吸收的作用[14]。本研究結果顯示，通過博來霉素制作的肺纖維化大鼠模型組與空白組比較，肺泡壁增寬增厚，肺組織結構紊亂，炎性細胞滲出明顯，表示造模成功，而TNF-α、IL-1β、IL-6明顯升高，表示炎性因子在肺纖維化中發揮重要作用。與模型組比較，藥物干預組肺組織少量炎性細胞浸潤，肺泡壁較薄，TNF-α、IL-1β、IL-6降低，且隨著劑量上升，指標下降更明顯。與甲潑尼龍組比較，桃紅四物湯低劑量組肺組織損傷更嚴重，炎癥因子升高；桃紅四物湯高劑量組肺組織及炎性因子無明顯變化。這說明桃紅四物湯能明顯降低肺纖維化中的炎性因子，改善肺纖維化組織結構，其中高劑量組效果與甲潑尼龍相似，病理結果也證實了此結論。

綜上，桃紅四物湯可以抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的釋放，通過抗炎作用發揮抗纖維化作用，其抗纖維化機制有待進一步明確。