高通量測序技術在鸚鵡熱肺炎診斷中的意義

羅運山，覃東翔，張 曼

來賓市人民醫院，廣西 來賓 546100

社區獲得性肺炎是臨床上常見的呼吸道疾病之一，由于病原菌構成復雜，經驗性應用抗菌藥物難度日益增大，特別是急危重癥感染患者如何通過“精準診斷”到“精準治療”從而提高救治成功率是臨床醫生迫切愿望。目前高通量測序技術就是最好的技術之一，特別是在檢測時間、敏感性、特異性等方面具有優勢。本文應用高通量測序技術確診少見疾病重癥鸚鵡熱肺炎1例，現報告如下。

1 病例資料

患者男，46歲，職業：割草工人。因“咳嗽、咳痰伴發熱6 d、氣促4 d”于2020年6月4日由外院轉入來賓市人民醫院重癥醫學科。患者入醫院前6 d出現咳嗽，為陣發性咳嗽，咳痰，痰液不多，呈黃色，伴發熱，最高達40℃，畏寒，全身肌肉酸痛，無鼻塞、流涕，無盜汗、咯血，無惡心及嘔吐，于當地人民醫院就診，病情逐漸加重，出現氣促，遂入院。由于患者氣促明顯，血氧飽和度低，直接收入本院科室。患者既往體健，入院查體：體溫39.6℃，心率86次/min，呼吸40次/min，血壓91/53 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），經皮血氧飽和度85%，入科血氣分析提示：酸堿度7.52、二氧化碳分壓21 mmHg、氧分壓58 mmHg、實際碳酸氫鹽 17.10 mmol/L、堿剩余為-5.80 mmol/L。初步診斷：（1）重癥肺炎、呼吸衰竭；（2）急性呼吸窘迫綜合征。

入科當天查胸片提示：左肺不張、實變，見圖1，給予氣管插管，呼吸機參數：純氧（100%）、peep（14 cmH20）等高參數的情況下，吸痰見大量水樣黃色液體，經皮血氧飽和度僅能勉強維持在90%左右，血流動力學需血管活性藥物維持（去甲腎上腺素1.0μg/kg.min）下血壓勉強維持正常范圍，經驗性給予美羅培南+莫西沙星抗感染、祛痰等治療，行相關檢查結果回報降鈣素原6.03 ng/ml，血常規：WBC 8.12×109/L，N 87.6%，ESR 85.5 mm/h，乳酸1.7 mmol/L，肥達氏反應、肺炎支原體抗體、呼吸道病毒病原體11項、結締組織疾病相關檢查均陰性、N末端-B型利鈉肽前提6 120 pg/mL。肝功能：總膽紅素55.09 umol/L，直接膽紅素35.59 umol/L，間接膽紅素19.50 umol/L，谷丙轉氨酶64.00 U/L，谷草轉氨酶221.00 U/L，總蛋白46.10 g/l，白蛋白19.90 g/L。心肌酶：肌酸激酶1399.00 U/L，肌酸激酶同工酶＜3U/L，肌紅蛋白572.50 ng/mL，乳酸脫氫酶1 886.26 U/L，肌鈣蛋白Ⅰ0.05 ng/mL。病原學培養陰性（血液、尿液、痰結核及涂片等）由于病原學不明，隨后行血及肺泡灌洗液（BALF）高通量基因測序示鸚鵡熱衣原體（+）。予以多西環素靜滴抗鸚鵡熱衣原體治療，嚴格液體管理，經治療后復查胸片左肺逐漸復張，見圖2。繼續原方案治療，病情逐漸好轉并復查降鈣素原0.08 ng/mL且CRP，體溫均下降，復查胸片明顯好轉，見圖3，隨后撤機，并生命體征平穩后轉出ICU。轉出ICU時血常規：WBC5.54×109/L，N60.3%，血漿乳酸1.60 mmol/L，N末端-B型利鈉肽前提254 pg/mL。肝功能：總膽紅素20.69 umol/L，直接膽紅素11.29 umol/L，間接膽紅素9.40 umol/L，谷丙轉氨酶43.000 U/L，谷草轉氨酶38.00 U/L，總蛋白70.40 g/L，白蛋白35.6g/L。心肌酶：肌酸激酶＜20 U/L肌酸激酶同工酶＜3 U/L，肌紅蛋白13.02 ng/ml，乳酸脫氫酶511.7 U/L，肌鈣蛋白Ⅰ＜0.012 ng/mL。針對該例患者宗合其臨床表現、病原學結果、治療反應，故鸚鵡熱衣原體肺炎診斷明確。

圖1 入科時胸片

圖2 6月8日胸片

圖3 6月19日胸片

2 討論

隨著寵物鳥類飼養的不斷增多，保護動物的法律逐漸健全，動物的遷徙規模不斷壯大，出現鸚鵡熱衣原體感染的可能性亦可增加［1］。目前多數歐美國家、日本以及我國香港地區等已將鸚鵡熱列入法定傳染病進行監測。鸚鵡熱衣原體形態學表現為革蘭氏陰性、球形病原體，細胞菌內寄生，是流行性鳥類衣原體和哺乳動物流行的病原體，典型的傳播途徑是鳥類通過眼睛、腸道的排泄物排出有傳染性的病原體，在處理受感染鳥類的羽毛和組織等亦可被感染，而飼養鳥類人員、獸醫、割草工人等為常見暴露職業［2］。鳥—人的感染方式是氣溶膠呼吸道吸入。鸚鵡熱衣原體經呼吸道吸入體內后首先進入肝和脾的網狀內皮細胞增殖，再經血液進入肺和其他器官［3］。鸚鵡熱臨床表現有多樣性、非特異性，可累及多個系統，肺部常表現為：氣短、咳嗽，肺部聽診可聞及啰音，影像結果往往比體格檢查表現更為嚴重，甚至進展至ARDS。鸚鵡熱衣原體感染臨床表現從輕癥到爆發型都有，雖然在社區獲得性肺炎中不常見，據有關報道約占1%［4］，如不積極治療病死率高。

本例患者入院后多次行病原學檢查如血培養、痰培養以及肺泡灌洗液培養均未找到病原菌，說明在目前的實驗室條件下要做到精確診斷還是困難，缺乏常規檢測方法，而通過肺泡灌洗液及血液送高通量測序均檢出鸚鵡熱衣原體，隨后實行“精準治療”病情逐漸好轉。

二代測序技術（NGS）又稱高通量測序技術，以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志。宏基因組二代測序（mNGS）不依賴于傳統的微生物培養，而是直接從臨床標本中提取全部微生物的DNA。mNGS技術目前在臨床上已被廣泛應用于急危重癥和疑難感染性疾病的診斷。對于臨床上不明原因的感染性疾病，特別是危重癥患者，病原體復雜，短時間是否明確致病微生物至關重要。而應用mNGS檢測，對提高疾病診斷及救治率提供了極大的幫助。結合本病例，患者平素體健，免疫正常，但起病急，病情進展快，甚至危及生命，單純從臨床表現、實驗室檢查、流行病學等方面并無明顯特異性，這對我們臨床醫生來說挑戰極大，經驗性應用抗菌藥物往往難以覆蓋病原菌，導致效果不佳。通過mNGS檢測，可快速明確病原菌，從而實現“精準診斷”，及時調整治療方案，針對性使用抗菌藥物，做到“精準治療”，縮短病程，提高救治成功率。據Xie Y等［5］研究報道，通過mNGS檢測明確致病微生物，及時調整治療方案，患者28、90 d生存率均明顯提高，90 d生存率由57.7%上升至83.3%。據《中國成人醫院獲得性肺炎與呼吸機相關性肺炎診斷和治療指南》［6］中明確推薦mNGS技術用于病原學檢測。而《宏基因組分析和診斷技術在急危重癥感染應用的專家共識》推薦mNGS在急危重癥感染患者中應用的主要適應證：（1）病情危重需要盡快明確病原體；（2）特殊病患者如免疫抑制宿主、合并基礎疾病、反復住院的重癥感染患者需要盡快明確病原體；（3）傳統微生物檢測技術反復陰性且治療效果不佳；（4）疑似新發病原體、臨床上提示可能有一定的傳染性；（5）疑似特殊病原體感染；（6）長期發熱和（或）伴有其他臨床癥狀、病因不明的感染。符合以上適應證的患者，應盡快送標本進行檢測。mNGS與傳統微生物檢測比較具有敏感性高、信息量大，可將送檢標本中的所有微生物“一網打盡”，但臨床上該如何解讀報告，這需要遵循送檢標本檢測的病原菌的檢出序列數、檢測深度、檢測離散度和基因組覆蓋度越高，說明檢測到該微生物可靠性越高。針對鸚鵡熱衣原體肺炎抗菌藥物首選四環素類藥物，但有研究報道近年發現衣原體屬中的沙眼衣原體對四環素類耐藥呈上升趨勢。目前國內尚缺乏針對鸚鵡熱衣原體進行體外藥敏實驗，臨床需結合治療效果進行評估。

當然，mNGS亦有自身局限性，首先比如對結核分枝桿菌、軍團菌、布魯菌等胞內菌因釋放至體液中含量有限以及對細胞壁較厚的微生物如真菌，其核酸提取效率較低，檢出率低。其次，RNA微生物的提取，由于RNA容易降解，相對于其他微生物其運送、保存要求高等因素亦導致檢出率下降。