綏李3 號李葉芽萌發過程中內源激素含量的變化*

周 雙，孫 偉，楊 光，焦奎寶，王明潔，唐 克，吳雨蹊，孫毅民，高 媛

（1 黑龍江省農業科學院鄉村振興科技研究所，哈爾濱 150027）（2 黑龍江工商學院）

內源激素是植物體中重要的活性物質，它參與并調控植物整個生長發育過程。植物體中有多種內源激素，且每種激素的調控作用不盡相同[1-3]。吲哚乙酸（IAA）具有促進生長的作用，通過不同濃度調整其在植物不同的部位產生的發育效應，并且不同的組織對IAA 濃度的反應差異很大。此外，吲哚乙酸與其他激素相互作用，從而刺激或抑制各種發育過程，在各種酶反應、細胞分化至形態建成都起到至關重要作用[4]。赤霉素（GA）的典型生理作用就是促進細胞的伸長從而促進生長，并在種子萌發到開花結果等植物的各種生理現象中發揮重要作用。赤霉素在果樹上應用廣泛，可誘導無核果實，打破芽休眠，防止落果，調控植株衰老等過程[5-7]。脫落酸（ABA）主要的生理作用是促進休眠、抑制植株生長[8]，脫落酸在植物體內分布廣泛。另外，脫落酸是誘導花芽分化、提高抗逆性的重要物質[9]。玉米素（ZT）作為細胞分裂素的一種，對植物生長發育過程的作用非常廣泛，從基因水平、生理生化水平、細胞水平以至整株發育水平都有深刻的影響。玉米素可以刺激細胞的分裂分化，并且在解除休眠、打破頂端優勢、調配養分、抑制衰老[10]、促進黃化幼苗中葉綠體的成熟等方面起著重要作用。玉米素通常與生長素協同作用，在有生長素存在時，不同濃度的細胞分裂素不僅在培養煙草髓組織時促進根、莖干生長，還能使非機體形成胼胝體，促進植物生長。

植物激素對植物的萌發、細胞分化、花芽分化、果實成熟等生理活動起著至關重要的調控作用。檢測植物內源激素的常用方法有：氣相色譜法（GC）、酶聯免疫法（ELISA）、液相色譜串聯質譜法（HPLC-MS）、氣相色譜串聯質譜（GC-MS）和高效液相色譜法（HPLC）等[10]。GC 法是分析植物中乙烯含量最普遍的方法；ELISA 法具有操作簡單、快速、敏感性高的特點，但重現性差、易交叉感染、不能同時分析多種激素，在精確定量測定方面存在不足；HPLC-MS 法可以直接分析激素，分析速度快，定性分析結果可靠，但儀器的高成本阻礙了其更廣泛的應用；GC-MS 法廣泛應用于有機物的現場分析檢測，定量分析精度高，定性能力高，但維護成本高，結構復雜，對實驗人員操作具有較高要求[11]；HPLC 法較其他方法具有靈敏度高、選擇性強、重復性好和分析速度快等特點，被廣泛用于植物激素的測定[12]。

芽的休眠由內源激素控制，休眠的起始、萌發和調控以及休眠階段的改變均受激素調節[13]。果樹花芽分化的相關激素研究已有相關報道[14-17]，但葉芽萌發過程中內源激素變化卻鮮有報道。李葉芽屬于純芽，存在2 種著生形態，一是單純的葉芽，二是復芽中與花芽伴生的葉芽（復葉芽），李葉芽萌發是李樹枝葉形成的基礎，葉芽萌發的質量影響樹體的生長發育，通過研究李樹葉芽萌發過程中內源激素含量的變化情況，以探究內源激素在葉芽萌發過程中的變化規律及各激素所起的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于黑龍江省綏棱縣城西1 km，地處北緯47°14′，東經127°06′，海拔202.7 m。屬大陸性季風氣候，年平均氣溫1.4 ℃，1 月平均氣溫-22.6 ℃，7 月平均氣溫21.8 ℃，有效積溫2 200～2 400 ℃（≥10 ℃），無霜期118.2 d，平均年降水量551.5 mm。土壤為淋溶黑鈣土，較黏重，pH值為6.8～7.3，有機質含量4.04%～4.16%。

1.2 試驗材料

供試材料采自黑龍江省農業科學院鄉村振興科技研究所綏棱基地綏李3 號試驗園，試材為成齡綏李3 號李樹上的葉芽。綏李3 號是由黑龍江省農業科學院鄉村振興科技研究所經有性雜交選育而成，樹姿較直立，萌芽力強，成枝力中等；抗寒、豐產，以花束狀果枝結果為主。果實圓形，大而整齊，平均單果重48.4 g，最大果重84.0 g；果肉黃色，纖維少，汁多、味甜，有香氣，可溶性固形物含量16.6%；核小、黏核；較耐貯運。該品種是黑龍江省的主栽品種之一，此外，吉林、遼寧、內蒙古、新疆等地都有栽培。

分別于2020 年4 月7 日（李芽休眠即將結束）、4 月14 日（葉芽即將萌動，芽鱗片松動）、4 月21日（葉芽鱗片開裂）、4 月28 日（葉芽加長變大，芽尖出現前）、5 月5 日（葉芽出現芽鞘）、5 月12 日（葉芽芽尖顯現綠色）采集純葉芽、復葉芽，共取樣6 次。取樣后樣品立即置于液氮中，于-80 ℃冰箱中保存，待測。

測試試劑：吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA）、脫落酸（ABA）、玉米素（ZT）的標準品均購自美國Sigma 公司。標樣稀釋濃度：IAA（1.000、0.500、0.250、0.125、0.050 g/L），GA（20.0、10.0、5.0、2.5、1.0 g/L），ABA（0.100、0.050、0.025、0.012 5、0.005 g/L），ZT（0.100、0.050、0.025、0.012 5、0.005 g/L）。

1.3 試驗方法

利用高效液相色譜法（HPLC）對IAA、GA、ABA、ZT 的含量進行測定。儀器為日本島津高效液相色譜儀LC-2010HT。流動相配制：分別量取甲醇45 mL、超純水55 mL 混勻溶解。HPLC 液相條件：色譜柱為SymmetryRC18 柱，3.5 μm，4.6 mm×75 mm，進樣量為10 μL，流速：0.7 mL/min，檢測波長：254 nm，柱溫：30 ℃。檢測器：氫離子火焰檢測器。

稱取葉芽0.5 g 冰浴研磨后加入20 mL 預冷的80%甲醇，在4 ℃冷浸過夜。抽濾2 次，合并濾液，40 ℃氮吹至無甲醇。加入30 mL 石油醚萃取脫色2次，保留水相。水相pH 值調至6.4，加0.5 g PVP，超聲30 min，抽濾。濾液pH 值調至2.9，用30 mL乙酸乙酯萃取3 次，合并酯相，減壓濃縮。45%甲醇溶解，并定容至2 mL，用0.45 μm 微孔濾膜過濾。待測液保存在4 ℃冰箱中。

取待測液10 mL，在選定的色譜條件下置于高效液相色譜儀，測定各激素的含量。

1.4 數據分析

數據用Excel 進行統計并作圖。

2 結果與分析

2.1 不同葉芽中內源激素含量的變化

由圖1-A 可以看出，純葉芽中IAA 含量總體呈現先上升后降低的趨勢，在芽鱗片松動前有一個大幅提升（4 月14 日），達到最大值，為98.05 μg/g，較初始值提高了251.43%。IAA 含量的這種變化發生在鱗片松動前，葉芽鱗片松動是葉芽即將萌發、開始生長的一個重要形態變化，說明葉芽在鱗片松動這樣重要的形態變化前需要較高水平的IAA 作基礎，當高濃度IAA 成功激發了重要形態變化，葉芽進入萌發狀態后，低水平的IAA 即可維持葉芽的后續生長發育，IAA 含量隨后降低。芽尖出現前（4月28 日）IAA 含量又有一個小幅上升，可能葉芽芽尖的出現也是葉芽生長的一個較重要的形態變化，同葉芽鱗片開裂一樣，需要一定濃度的IAA 作基礎。IAA 含量的升高和降低，是為了保證葉芽重要形態變化的需求，維持葉芽的正常發育和生長。復葉芽與純葉芽的變化相似，但復葉芽中的IAA 含量的提升較純葉芽晚一些，高峰出現在鱗片開裂時的4 月21 日，含量為68.83 μg/g，較初始值提高了20.59%。

圖1 不同葉芽中內源激素含量的變化

由圖1-B 可知，不同葉芽中的GA 含量的變化趨勢不盡相同。純葉芽中GA 含量呈現先升高后降低的單峰趨勢，在整個葉芽萌發期間對GA 的需求量都比較高，其中在葉芽鱗片開裂時期（4 月21 日）對GA 需要最多，其值為379.24 μg/g，較初始值提高了477.67%。復葉芽由于受到花芽的影響，使得復葉芽在萌發期間GA 的含量呈現M 形變化趨勢，其2 次升高分別在4 月14 日（葉芽即將萌動）和5月5 日（葉芽出現芽鞘），其值分別為330.80、294.22 μg/g，分別較初始值提高了157.55%、129.07%。并且在整個萌發期間復葉芽對GA 的需求早于純葉芽，需求量也普遍高于純葉芽。說明GA 在葉芽萌發中期起著關鍵作用。

由圖1-C 可看到，不同葉芽的ABA 含量變化有明顯不同。ABA 在2 種葉芽中，前期含量均在較高水平，這可能是李芽休眠狀態的正常含量（4 月7 日各芽均處于休眠狀態），隨著芽的形態變化，ABA 含量開始發生變化。純葉芽中的ABA 含量呈現先下降后上升再下降的趨勢，在4 月14 日下降到最低，在為萌發做準備；在激發了葉芽萌發的啟動因子后，ABA 含量急劇升高，在4 月21 日，其含量從 11.91 μg/g 升高到 75.49 μg/g，提高了533.84%，可能是葉芽鱗片松動與脫落需要一定含量的ABA；隨后一直緩慢下降，則是葉芽開始進入平穩、緩慢生長期，對ABA 的需求降低。復葉芽呈現先升高后降低再升高再降低的趨勢，分別在4月14 日和4 月28 日有2 個躍升，含量分別為62.34、82.20 μg/g，分別較初始值升高了20.53%、58.93%。最大的躍升時期比純葉芽出現的晚些，這2 個躍升期均在純葉芽中的ABA 下降時出現，可能也是因為復葉芽與花芽相鄰緊密，為保證花芽的正常生長發育而出現的自我調節，同時也驗證了葉芽的生長勢要比花芽強。葉芽在一定時期通過改變ABA 含量控制自身長勢，來保證花芽的正常生長發育。

由圖1-D 可知，不同葉芽的ZT 含量變化明顯不同。純葉芽內的ZT 含量先下降后小幅度升高再逐漸下降；復葉芽內的ZT 含量呈現先升高后降低的趨勢。純葉芽和復葉芽均在4 月21 日出現躍升，這一時期正是葉芽鱗片開裂時期，說明ZT 在葉芽的萌動中期起著重要的作用，葉芽萌動需要ZT 一定的濃度作為保證。復葉芽中的ZT 含量在4 月21日躍升幅度較大，含量為124.46 μg/g，較初始值提高了712.93%，可能是因為受緊密相鄰的花芽的影響，它的萌發需要更高濃度的ZT 來激發。2 種葉芽在萌動發育迅速時期（4 月14—28 日）細胞分裂旺盛，對ZT 的需求量均較大。

2.2 內源激素含量的比值對葉芽的影響

植物的生長發育不是激素單獨作用的結果，而是多個激素通過改變其比值從而協調或拮抗作用反應到發育過程。通常促進型激素GA 和IAA 與抑制型激素ABA 的比值能夠反映植物的生長狀態，比值高說明促進型激素占優勢，植物加速生長；比值低說明抑制型激素占優勢，植物生長緩慢或處于休眠狀態[18]。

試驗結果表明，純葉芽（IAA＋GA）/ABA 的值呈現先升高再降低的趨勢，如圖2-A 所示。在葉芽萌動初期（4 月7—21 日），純葉芽生長旺盛，IAA 和GA 總含量比較占優勢，并在4 月14 日出現生長高峰，4 月21 日鱗片開裂后，葉芽生長稍緩；5 月5 日（葉芽出現芽鞘）后，葉芽萌發生長加快，對促進型激素需求再次增加。由于復葉芽受花芽影響，整個萌發期間，（IAA＋GA）/ABA 的值呈現M形變化趨勢，在4 月14 日，出現第1 個生長高峰，但（IAA＋GA）/ABA 的值均低于純葉芽，在5 月5日出現第2 個生長高峰，比值高于純葉芽，說明復葉芽在萌發過程中是初期較緩，后期生長迅速。

圖2 不同葉芽中內源激素含量比值的變化

從圖2-B 可以看出，在整個葉芽萌發過程中（4月7 日至5 月5 日），純葉芽ZT/ABA 的值呈現下降趨勢，說明ZT 與ABA 的比值對純葉芽萌發的影響較小。然而復葉芽ZT/ABA 的值呈現先升高后降低的趨勢，且變化范圍較大，說明在萌動中期ZT與ABA 的比值對復葉芽影響較大，并且至關重要。

3 結論與討論

2 種葉芽中的IAA 含量變化的總趨勢是下降，葉芽形態變化前的啟動因子需較高水平的IAA 來啟動，啟動后則需求降低。IAA 并不是在形態變化過程中發揮最大作用，而是在形態變化之前就已經開始積累，達到最高值，激發形態變化的啟動因子時，IAA 發揮最重要作用。IAA 與其他激素的協同作用可能是調節葉芽萌發的方式。不同葉芽對IAA濃度的反應存在差異，由于復葉芽是與花芽伴生，在萌發時，受花芽的影響，其含量變化較純葉芽遲緩。

試驗研究表明，GA 與落葉果樹芽休眠和萌發之間存在緊密聯系[19]。本試驗發現，2 種葉芽在萌發過程中對GA 需求量較大，這證實了GA 在抑制芽的休眠、促進芽的萌發中具有重要作用。不同葉芽在萌發的不同階段對GA 的需求也存在差異，純葉芽中GA 的含量呈現先升高后降低的單峰趨勢，而復葉芽在萌發期間GA 含量呈現M 形變化趨勢，說明葉芽的萌發不是單純依靠GA，而是通過多種激素平衡互作的結果。

關于ABA 與葉芽萌發的關系，本試驗發現，在葉芽萌發過程中ABA 呈現逐漸升高再降低的趨勢，說明解除休眠并未帶來ABA 的降低，ABA 與其他激素相互作用而起到調節葉芽萌發和營養物質加速積累的作用，在葉芽形態分化期間起到促進作用。

曾輝等[20]研究澳洲堅果內源玉米素與其花芽分化關系時發現，其葉片、枝條和細根中較高濃度的ZT 有利于花芽的分化。在本試驗中，ZT 在2 種葉芽的萌發前期需求較低，在萌發中期需求量增加，然而后期又降低，尤其復葉芽受花芽影響對ZT 的需求更大，說明ZT 是在葉芽萌發中期起著重要作用。在本試驗中還發現，復葉芽在萌發中期對ZT的需求量遠高于純葉芽，說明復葉芽受花芽的影響較大。

葉芽的萌發不僅是單一激素作用，而是多個激素協同作用的結果，（IAA＋GA）/ABA 的值對2種葉芽的影響存在差異。純葉芽在萌動前期（IAA＋GA）與ABA 的比值較高，中后期逐漸降低，說明促進型激素在萌芽前期占主導作用，有利于葉芽打破休眠，促進萌發。而促進型激素對復葉芽促進作用分2 個階段，前期生長稍緩，后期生長迅速，這與鄰近花芽有關。

在整個葉芽萌發過程中，純葉芽ZT/ABA 的值呈現下降趨勢，說明ZT 與ABA 的比值對純葉芽萌發的影響較小。然而復葉芽ZT/ABA 的值在萌動中期變化較大，說明受花芽影響，復葉芽對ZT 與ABA的比值需求增加，調動更多養分促進細胞分裂，從而利于自身萌發。