蘋果黑星病有效防治藥劑篩選及施藥適期研究*

郭 健，任維超，李保華

（青島農(nóng)業(yè)大學植物醫(yī)學學院，山東 266109）

由蘋果黑星病菌（Venturia inaequalis(Cooke)Wint.）引起的蘋果黑星病又稱蘋果瘡痂病、蘋果黑點病，在世界各蘋果產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生[1-2]。蘋果黑星病主要危害葉片和果實，也可侵染葉柄、花、萼片、花梗、嫩枝和芽鱗等多個部位，導致早期落葉，果實瘡痂、畸形，影響蘋果的產(chǎn)量、品質(zhì)及其商品價值，嚴重的年份經(jīng)濟損失超過70%[1-3]。蘋果黑星病菌主要以未成熟的假囊殼在落地的病葉上越冬[4-6]，也以菌絲體或分生孢子在芽鱗內(nèi)越冬[7]。翌年花期前后，產(chǎn)生子囊孢子和分生孢子侵染幼嫩組織，初侵染病斑顯癥后，產(chǎn)生大量分生孢子，隨雨水傳播再侵染。4—6 月雨水較多，6 月底可造成嚴重危害。

蘋果黑星病在我國屬于區(qū)域性的檢疫病害[8-9]。近年來，部分蘋果產(chǎn)區(qū)發(fā)生嚴重，并且有向其他種植區(qū)擴展蔓延的趨勢[3,10-13]。清除果園地面上的越冬病葉，春季噴施化學藥劑是目前防治蘋果黑星病的主要技術(shù)措施[11-12,14]。然而，在實際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，用于防治蘋果黑星病的高效藥劑氟硅唑?qū)μO果早期生長有抑制作用，而苯醚甲環(huán)唑等藥劑的防治效果又不理想。為了篩選防治蘋果黑星病的高效藥劑，控制蘋果黑星病的擴展蔓延，本研究測試了9 種殺菌劑對蘋果黑星病的防治效果，旨在為蘋果黑星病的防治提供高效藥劑和適宜的施藥時期。

1 材料與方法

1.1 供試病菌

2019 年10 月從病區(qū)采集感染蘋果黑星病的病葉，陰干，保存于-18 ℃冰箱。2020 年4 月，取保存的蘋果黑星病葉，用純凈水將病葉上的分生孢子洗下，配制成1.0×104個/L 孢子的孢子懸浮液，加入0.1%的吐溫20，噴霧接種嘎拉蘋果的新梢，接種后套塑料袋保濕24 h。30 d 后待接種葉片充分發(fā)病并產(chǎn)孢后，取病葉上的新鮮孢子，配制成1.0×106個/L 的孢子懸浮液用于室內(nèi)藥劑毒力測定，1.0×104個/L 的孢子懸浮液用于田間藥效試驗。孢子懸浮液隨配隨用，放置時間不超過30 min。

1.2 供試藥劑

根據(jù)相關(guān)的研究報道，結(jié)合應(yīng)用成本、國內(nèi)生產(chǎn)能力等因素，選擇了9 種殺菌劑作為供試藥劑，其中3 種屬于琥珀酸脫氫酶抑制劑（表1）。測試藥劑若為原藥，則用甲醇配制成1.0×104mg/L 的母液，用于室內(nèi)毒力測定。測試藥劑若為制劑，則直接用滅菌的蒸餾水稀釋成相應(yīng)劑量，用于室內(nèi)毒力測定和室外藥效試驗。

表1 蘋果黑星病毒力測定和藥效試驗所使用的藥劑的名稱、劑型、劑量和生產(chǎn)廠家

1.3 藥劑室內(nèi)毒力測定

不同藥劑對蘋果黑星病菌分生孢子萌發(fā)的抑制效果采用孢子萌發(fā)法測定[15-17]。根據(jù)預備試驗確定的劑量，參考生長速率抑制法，將供試藥劑加入到2%的水瓊脂中，混勻后配成系列濃度的含藥水瓊脂平板，以不加藥劑的水瓊脂平板為對照。用移液槍取300 μL 孢子懸浮液，滴加到水瓊脂平板上，涂布均勻，待水分晾干，轉(zhuǎn)于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h 后取出，在100 倍顯微鏡下檢查孢子的萌發(fā)率。每種藥劑5 個濃度，每個濃度5 個平板，每個平板隨機檢查5 個有10～30 個孢子的視野，記錄萌發(fā)孢子數(shù)和未萌發(fā)孢子數(shù)。當孢子芽管長度超過孢子縱徑的一半時，記為萌發(fā)。全部試驗獨立重復3 次。

以對照組的孢子的平均萌發(fā)率校正萌發(fā)孢子數(shù)和未萌發(fā)孢子數(shù)，將劑量轉(zhuǎn)換為劑量對數(shù)。以劑量對數(shù)為自變量，以校正的未萌發(fā)孢子數(shù)和相應(yīng)的萌發(fā)孢子數(shù)為因變量，擬合廣義線性模型（GLM），GLM 模型中的family 參數(shù)選擇二項分布（Binomial）。依據(jù)擬合模型，計算EC50和置信區(qū)間。數(shù)據(jù)分析在R（Ver.3.6.0）中完成。

1.4 殺菌劑的保護效果

在室外通過先施藥后接種的方法[18-20]，測試了9種殺菌劑保護葉片阻止蘋果黑星病菌分生孢子侵染的效果。每種藥劑設(shè)置2 個接種時間，即施藥后第1 d 和第5 d 接種，以清水為對照，共計20 個處理。每個處理接種1 個蘋果新梢，每個新梢保證有5 片完全展開的幼嫩葉片。試驗時，從3～4 株3 年生的盆栽富士蘋果樹上選取20 個新梢作為1 次重復，全部試驗在不同的蘋果樹上重復3 次。

2020 年7 月下旬蘋果二次梢生長期，從11 株樹上選擇并標記60 個具有5 片完整幼嫩葉片的二次新梢，將藥液噴施到標記新梢上，直到藥液流下為止。為了防止藥劑交叉污染，噴藥時用塑料桶遮住噴霧器和處理梢。分別于噴藥后（施藥當天為第0 d）的第1 d 和第5 d，選擇傍晚或陰雨天，用手持小噴壺將黑星病菌的分生孢子懸浮液噴霧接種到相應(yīng)的新梢上，直到接種葉片上有孢子懸浮液流下為止。接種后，用塑料袋包嚴整個接種梢，保濕24 h。為了避免病菌的交叉感染，接種時也用塑料桶遮住小噴壺和處理梢。

待接種葉片充分發(fā)病后，調(diào)查記錄每個葉片上的病斑數(shù)。為了促進潛育病菌充分顯癥，將所有接種梢同5 個接種葉片全部剪下，置于保濕箱內(nèi)，在20 ℃恒溫箱內(nèi)保濕培養(yǎng)24 h，待潛育病斑充分顯癥后，再次檢查每個接種葉片正面和背面的病斑數(shù)。將保濕處理后每個接種梢上5 片葉片的病斑數(shù)累加，用于統(tǒng)計分析。

以藥劑為處理因子，每個重復所有葉片上的總病斑數(shù)為效應(yīng)因子，擬合廣義線性模型（GLM）。GLM 模型中，family 參數(shù)選擇泊松分布（Poisson）。通過分析嵌套模型的變異度分析，比較了9 種殺菌劑對黑星病斑的保護效果。2 次接種數(shù)據(jù)分別分析。

1.5 殺菌劑的內(nèi)吸治療效果

在室外通過先接種后施藥的方法[18-20]，測試9種內(nèi)吸性殺菌劑對蘋果黑星病的治療效果。藥劑于病菌接種后（接種當天記為第0 d）第4 d 噴施藥，以清水為對照，共計10 個處理，每個處理接種1個蘋果新梢，每個新梢保證有5 片完全展開的幼嫩葉片。試驗時，從2～3 株3 年生的盆栽富士蘋果樹上選擇10 個新梢作為1 次重復。全部試驗在不同的蘋果樹上重復3 次。

2020 年7 月下旬蘋果二次新梢生長期，在8 株樹上選擇并標記30 個具有5 片完整幼嫩葉片的二次新梢，于傍晚或陰雨天，用手持小噴壺將黑星病菌的分生孢子懸浮液噴霧接種到標記的新梢上，直到接種葉片上有孢子懸浮液流下為止。接種后，用塑料袋包嚴整個接種梢，保濕24 h。接種后第4 d，將藥液噴施到相應(yīng)的接種梢上，直到藥液流下為止。為了防止藥劑交叉污染，噴藥時用塑料桶遮住噴霧器和處理梢。病斑的檢查方法和藥劑內(nèi)吸治療效果的分析方法同藥劑保護效果試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 9 種殺菌劑對蘋果黑星病菌的室內(nèi)毒力

在25 ℃下培養(yǎng)24 h 后，蘋果黑星病菌分生孢子在2%的水瓊脂平板上萌發(fā)率在53%～64%之間，平均為57.3%；在含藥的水瓊脂平板上，孢子萌發(fā)率在1%～56%之間，校正萌發(fā)率在2%～97%之間。所測試9 種殺菌劑中，氟啶胺對蘋果黑星病分生孢子萌發(fā)的抑制效果最好，EC50為0.003 0 mg/L；其次為氟唑菌酰羥胺，EC50為0.004 6 mg/L；克菌丹和咪鮮胺對黑星病菌分生孢子萌發(fā)的抑制中濃度較高，EC50分別為4.940 0 和4.540 0 mg/L；3 種琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑、吡唑醚菌酯對蘋果黑星病菌分生孢子的萌發(fā)抑制中濃度較低，EC50都小于0.01 mg/L（表2）。

表2 9 種殺菌劑對蘋果黑星病分生孢子萌發(fā)的抑制毒力

2.2 殺菌劑對蘋果黑星病的保護效果

藥劑保護效果試驗中，2 批葉片于接種后第20 d 開始陸續(xù)發(fā)病，第46 d，平均每片接種葉片上的病斑數(shù)為2.2 個，單片葉片病斑數(shù)最多為32 個。在25 ℃下保濕24 h 后，每片接種葉片上的平均病斑數(shù)增加至2.5 個，單片葉片最大病斑數(shù)增加至38 個。在施藥1 d 后接種的葉片上，9 種藥劑處理葉片上的病斑數(shù)顯著低于對照，對照每個梢上的總病斑數(shù)平均值為54.67 個，表明9 種藥劑都能有效保護蘋果葉片，抑制蘋果黑星病菌的侵染。其中，氟唑菌酰羥胺、克菌丹、吡唑醚菌酯、嘧霉胺、吡噻菌胺和苯醚甲環(huán)唑6 種藥劑的保護效果較好，用藥后第1 d 的保護效果都在90%以上。施藥后第5 d 接種的葉片上，9 種藥劑處理葉片上的病斑數(shù)顯著低于對照，對照每個梢上的總病斑數(shù)平均值為60.33 個，表明9 種測試藥劑在施藥后第5 d 都能有效抑制蘋果黑星病菌的侵染。其中，氟唑菌酰羥胺、克菌丹和吡噻菌胺的保護效果較好，噴藥后第5 d 的保護效果仍在90%以上（表3）。

表3 不同時間噴施9 種藥劑抑制蘋果黑星病菌侵染的效果

2.3 殺菌劑對蘋果黑星病的內(nèi)吸治療效果

在藥劑治療效果試驗中，用蘋果黑星病菌分生孢子噴霧接種18 d 后蘋果葉片開始發(fā)病。接種25 d后葉片上的平均病斑數(shù)達5.62 個，單片葉片上病斑數(shù)最多達54 個。在25 ℃下保濕24 h 后，每片葉片上的平均病斑數(shù)增加至9.35 個，單片葉片的最大病斑數(shù)增加至68 個。

從表4 可以看出，病原菌接種后第4 d 噴藥，氟唑菌酰羥胺、嘧霉胺、吡唑醚菌酯和苯醚甲環(huán)唑4 種藥劑處理5 片葉片上的總病斑數(shù)分別為2.00、12.33、22.33、23.67 個，顯著低于對照，對照每個梢上的總病斑數(shù)平均值為154.00 個。表明這4 種藥劑在接種后第4 d 施藥能有效抑制已侵染的黑星病菌擴展形成病斑，其中，氟唑菌酰羥胺的內(nèi)吸治療效果最好，達98.7%。

表4 病菌接種后第4 d 噴施9 種殺菌劑對蘋果黑星病的內(nèi)吸治療效果

3 討論與結(jié)論

測試的9 種殺菌劑按廠家推薦劑量使用時，都能較好地保護蘋果葉片阻止蘋果黑星病菌分生孢子的侵染，在施藥后的第5 d 保護效果在70%以上。所有測試藥劑都可以在病菌侵染前作為保護性殺菌劑使用，有效保護葉片和果實，避免其受到蘋果黑星病菌的侵染。其中，20%氟唑菌酰羥胺懸浮劑、80%克菌丹水分散粒劑和20%吡噻菌胺懸浮劑3 種藥劑的保護效果較好，用藥第5 d 保護效果仍達90%。然而，在所測試的9 種藥劑中，只有20%氟唑菌酰羥胺懸浮劑、40%嘧霉胺懸浮劑、25%吡唑醚菌酯乳油和10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑4 種藥劑在病菌侵染后的第4 d 噴施，能有效抑制病菌擴展形成病斑。因此，在9 種測試藥劑中，氟唑菌酰羥胺、嘧霉胺、吡唑醚菌酯和苯醚甲環(huán)唑4 種藥劑可作為防治蘋果黑星病的防治藥劑，在蘋果黑星病菌侵染前或侵染后的5 d 內(nèi)使用，可獲得良好的防治效果；克菌丹和吡噻菌胺可作為防治蘋果黑星病的保護劑使用，建議在蘋果黑星病菌侵染前的5 d 內(nèi)使用，可獲得良好的防治效果。

在所測試的9 種藥劑中，不同藥劑對蘋果黑星病菌分生孢子萌發(fā)的抑制中濃度差異較大。其中，3 種琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑對蘋果黑星病菌分生孢子的萌發(fā)抑制中濃度較低，除氟唑菌酰羥胺，氟啶胺和吡噻菌胺的加工制劑在活體葉片上的防治效果與其室內(nèi)毒力相比相差甚遠，沒有表現(xiàn)出其應(yīng)有的抑菌毒力，其原因尚不明確。加工劑型不能充分發(fā)揮其應(yīng)有毒力可能是重要原因。吡唑醚菌酯和苯醚甲環(huán)唑是近年來防治蘋果黑星病的推薦藥劑。本試驗測試結(jié)果也表明，吡唑醚菌酯對蘋果黑星病仍有較好的防治效果，苯醚甲環(huán)唑防治效果雖不理想，但仍然有效，2 種藥劑仍可作為防治蘋果黑星病的藥劑，應(yīng)與其他藥劑交替使用。嘧霉胺是防治灰霉病的主要藥劑。本試驗表明，嘧霉胺對蘋果黑星病有較好的內(nèi)吸治療效果，其效果好于吡唑醚菌酯和苯醚甲環(huán)唑，可在春季作為內(nèi)吸治療劑使用。克菌丹和吡噻菌胺對蘋果黑星病的保護效果很好，但沒有內(nèi)吸治療效果，可在降雨前作保護劑使用。2021 年，在黑星病的田間防治試驗中發(fā)現(xiàn)，氟吡菌酰胺與肟菌酯的混配制劑、氯氟醚菌酯與吡唑醚菌酯的混配制劑和氟吡菌酰胺與戊唑醇的混配制劑對蘋果黑星病也有較好的防治效果，其效果優(yōu)于苯醚甲環(huán)唑，但不及嘧霉胺（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。氟硅唑曾是防治蘋果黑星病的特效藥劑，然而國內(nèi)的應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，氟硅唑?qū)μO果幼果和新梢的生長有一定的抑制作用，不宜在蘋果幼果期或生長前期使用，但可以作為雨季防治蘋果黑星病的主要藥劑，用藥次數(shù)不能超過3 次。

4—6 月是蘋果黑星病的防治關(guān)鍵時期[5,21]。蘋果黑星病菌能以未成熟的假囊殼在落葉上越冬，或以菌絲在芽內(nèi)越冬。蘋果開花前后，越冬病菌產(chǎn)生子囊孢子和分生孢子，遇雨后釋放，并隨雨水和氣流傳播侵染蘋果幼嫩組織。對于蘋果黑星病的防治，應(yīng)于蘋果展葉后開花前結(jié)合蘋果銹病和蘋果白粉病的防治噴施內(nèi)吸治療性殺菌劑，如苯醚甲環(huán)唑等，防止在芽內(nèi)越冬的病菌擴展產(chǎn)孢，并保護幼嫩組織不受病菌侵染。蘋果謝花后，結(jié)合蘋果霉心病、蘋果銹病和蘋果白粉病的防治，噴施廣譜高效的保護性殺菌劑，如克菌丹、吡噻菌胺等，保護蘋果幼嫩組織，減少黑星病菌的侵染；若用藥前遇雨量超過10 mm 使葉果結(jié)露超過12 h 的降雨，需改噴內(nèi)吸治療性殺菌劑，如嘧霉胺、吡唑醚菌酯等。春季多雨年份，謝花后至幼果套袋應(yīng)結(jié)合其他病害的防治噴施1～2 次高效的內(nèi)吸治療性殺菌劑，如氟唑菌酰羥胺、嘧霉胺等。多雨年份，6 月進入雨季后，應(yīng)結(jié)合葉部、果實和枝干病害的防控，噴施1～2次對蘋果黑星病有內(nèi)吸治療效果的殺菌劑，如氟硅唑、氟唑菌酰羥胺等。