液相色譜-質譜/質譜法檢測蝦中四環素

◎ 包東東，唐 波，田 鋒，譚慧林

（阿克蘇地區食品安全檢測中心，新疆 阿克蘇 843000）

四環素類藥物（Tetracyclines，TCs）是一種天然或半人工合成藥物，能抑制和殺死多種革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、衣原體、支原體等致病微生物。四環素類藥物種類很多，有20余種，見的較多的有四環素、強力霉素、金霉素（Chlortetracycline，CTC）和土霉素等。在畜牧業養殖中，由于四環素類藥物價格偏低、抗菌效果顯著，被廣泛用于動物疾病防治中。因此，四環素類藥物的消耗量占動物疫情防控的總藥量偏高，其中歐盟約為46%，美國約為15.8%。四環素藥物的過量使用，導致動物源性食品和環境中四環素類藥物殘留較高。消費者長期食用四環素類藥物殘留超標的食品，可出現牙齒變黃、過敏反應、肝臟損傷、腸道紊亂等不良反應，部分動物源性食品中所含的四環素類等抗生素被食用后會造成機體發生過敏反應，部分患者可能出現蕁麻疹、急性血管性水腫、休克甚至死亡；部分藥物在被人體食用后還會誘發基因突變，引發“三致作用”，有的還可導致體內細菌耐藥性增強。四環素較穩定，可經尿、糞便排向外界環境，會引起環境污染，環境中藥物殘留可導致微生物耐藥性增強，出現新的耐藥菌株，給公共衛生造成危害。因此，加強動物源性食品四環素類藥物及其代謝物檢測，對保障公共衛生安全具有重要意義[1]。

檢測四環素藥物殘留的方法有儀器分析法、免疫學法、微生物法、生物傳感器等，其中被廣泛應用于檢驗分析的主要是儀器分析法和免疫學法。免疫學法由于操作簡單、檢測速度快、成本低、對檢驗人員專業要求不嚴格等優點多用于現場快速檢測及樣品初篩[2]。與免疫學法相比，儀器分析法具有結果準確可靠、重現性好、穩定性高等優點，并可實現對多類藥物的快速定量檢測，被用于藥物殘留檢測和確證。高效液相色譜法及液相色譜串聯質譜法是最常用的儀器分析法。

為確保本實驗室檢測動物源性食品中四環素殘留的準確性，本實驗室參加了中國檢驗檢疫科學研究院組織的蝦中四環素檢測能力驗證，樣品編號為7-F701，17-T228。本實驗室通過利用能力驗證這種外部質量保證工具，識別與同行機構之間的差異，補充內部質量控制技術，為自身的持續改進和質量管理提供信息[3]。此次能力驗證可判斷實驗室和檢查機構等是否具有從事校準/檢測活動的能力，以及監控能力的持續狀況，不斷提升檢驗檢測能力，打造重點綜合性實驗室。本實驗室采用了常用的檢測方法《動物源性食品中四環素類獸藥殘留量檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法與高效液相色譜法》（GB/T 21317—2007）進行檢測。在此次能力驗證中，利用現有的實驗室設備對標準方法進行了優化，最終取得了滿意結果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦粉樣品：中國檢驗檢疫科學研究院能力驗證樣品，樣品1編號為17-F701，樣品2編號為17-T228。

四環素標準品，1 000 mg·L-1，農業部保護科研監測所；檸檬酸，分析純，上海埃彼化學試劑有限公司；磷酸氫二鈉，分析純，天津恒信試劑廠；乙酸乙酯，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；乙二胺四乙酸二鈉，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；甲酸，色譜純，純度≥88%，上海安譜實驗科技股份有限公司；甲醇、乙腈，色譜純，純度99.9%，德國Merk公司；HLB固相萃取柱，60 mg/3 mL，上海安譜實驗科技股份有限公司；緩沖溶液：將1 000 mL 0.1 mol·L-1磷酸二鈉溶液與625 mL 0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液混合；Na2EDTA-McLLvaine緩沖溶液：秤取60.5 g乙二胺四乙酸二鈉放入1 625 mL McLLvaine緩沖溶液，使其溶解，搖勻。三氟乙酸溶液10 mmol·L-1。

1.2 儀器與設備

電子分析天平，感量0.01 g（梅特勒托利多）；液相色譜-質譜/質譜儀配有電噴霧（ESI）源（賽默飛世爾儀器公司）；超聲清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；低溫離心機，最高轉速5 000 r·min-1，控溫范圍為-40 ℃至室溫（湖南湘儀實驗儀器開發有限公司）；J2固相萃取儀（美國J2 Scientific）；氮吹儀（北京同泰聯科技發展）；渦旋儀（法國梅里埃）；pH計，測量精度±0.02（上海儀電物理光學儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

用四環素標準品（1 000 mg·L-1），按照 10倍稀釋梯度，分別配制成 0.02 mg·L-1、0.05 mg·L-1、0.10 mg·L-1、0.20 mg·L-1、0.30 mg·L-1和 0.50 mg·L-1一系列濃度標準溶液，密封待用。

1.3.2 檢測方法

試樣中的四環素殘留用0.1 mol·L-1Na2EDTAMcLLvaine緩沖溶液（pH=4.0）提取，經過濾、高速離心后，上清液經HLB固相萃取柱凈化，進液相色譜-質譜聯儀測定，外標峰面積法定量。

稱取蝦粉樣品3.00 g，加水復原至6 g，倒入50 mL聚丙烯離心管中，分別用約20 mL、20 mL、10 mL 0.1 mL·L-1Na2EDTA-McLLvaine緩沖溶液冰水浴超聲提取3次，每次渦旋混合1 min，超聲提取10 min，3 000 r·min-1離心5 min（溫度低于15 ℃），合并上清液，定容至50 mL，混勻，5 000 r·min-1離心10 min（溫度低于15 ℃），過濾，吸取10 mL濾液，過活化后的HLB固相萃取柱，樣液流完后，用5 mL水和5 mL甲醇+水（1+19，V/V）淋洗，用固相萃取儀吹干，再用10 mL甲醇+乙酸乙酯（1+9，V/V）洗脫，將濃縮液用氮吹儀吹干，用1 mL甲醇+三氟乙酸（1+19，V/V）溶液溶解殘渣，過0.22 μm濾膜，上機測定。

1.4 儀器條件及測定方法

1.4.1 液相及質譜條件

液相條件：色譜柱WATERS UPLC C8-3柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）；流動相：甲醇 +10 mmol·L-1三氟乙酸溶液（1+19，V/V）；流速：200 μL·min-1；柱溫度：30 ℃；進樣量：10 μL。

1.4.2 質譜條件

質譜儀離子化模式：電噴霧電離正離子模式（ESI+）；質譜掃描方式：多反應監測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；分辨率：單位分辨率；碰撞氣：20 L·h-（1氬氣）；去溶劑氣：500 L·h-1（氮氣）；離子源溫度：350 ℃。

2 結果與分析

2.1 前處理方法的優化

樣品凈化使用了HLB固相萃取柱、C18固相萃取柱，實驗表明，HLB固相萃取柱吸附容量是鍵合硅膠固定相的3～10倍[4]，可達到較好的凈化效果，因此選用HLB固相萃取柱為樣品凈化柱。考慮到液質方法中流動相為乙腈+水（1∶9，含0.2%甲酸）溶解，所以將標準溶液及前處理濃縮后殘渣均用10%乙腈與90%水進行溶解，其中水相含0.2%甲酸溶液，溶解后必須充分混勻。

2.2 液質聯用儀質譜條件優化

2.2.1 液相色譜條件優化

實驗中流動相使用了不同流速對液相色譜進行優化，分別使用 0.1 mL·min-1、0.2 mL·min-1、0.3 mL·min-1流速作為流動相；使用不同柱溫（30 ℃、35 ℃、40 ℃）、不同柱長的WATERS UPLC C8-3柱（100 mm×2.1 mm，5 μm）和WATERS UPLC C8-3柱（150 mm×10 mm，5 μm）分別進行實驗分析。實驗表明，0.2 mL·min-1流速符合實驗條件，同時可達到減少試劑使用量、廢液排出量等實驗目的；35 ℃柱溫條件下四環素藥物分離效果良好，峰形良好；色譜柱選用WATERS UPLC C8-3柱（100 mm×2.1 mm，5 μm），出峰時間提前0.5 min，且售價更加便宜。最終選擇0.2 mL·min-1的流速、柱溫35 ℃、WATERS UPLC C8-3柱（100 mm×2.1 mm，5 μm）為最佳色譜分離條件。

2.2.2 質譜條件的優化

有研究表明，四環素藥物易溶于有機溶劑，如乙腈、甲醇、丙酮、三氯甲烷等。實驗中，一般選擇甲醇、乙腈作為色譜流動相，在液相色譜質譜中乙腈的分離效果優于甲醇。在流動相中加入少量的酸可以提高電離效應、改善峰形。GB/T 21317—2007以三氟乙酸作為酸化試劑，但三氟乙酸對質譜信號有抑制作用，在使用過程中會殘留在離子通道及離子源中，污染儀器管路，使柱壓增高，降低儀器壽命，而在液相質譜中常使用甲酸作為流動相，使目標物分離效果好，污染少，有利于質譜儀的長期使用，因此選擇甲酸作為酸化試劑[5-6]。

實驗中配制了0.1%、0.2%、0.3%及0.4%濃度的甲酸水溶液，分別和乙腈組成流動相，將四環素目標物注入質譜儀，查看離子化效率。結果表明，甲酸濃度增高，液相質譜儀離子源靈敏度也隨之增高，考慮到甲酸溶液的濃度過高，對儀器泵、管路及離子源帶來損壞，而0.2%甲酸溶液已能滿足該實驗分離需要，峰形較好，無拖尾現象，因此選擇0.2%甲酸水溶液作為最終流動相。

將10 mg·L-1四環素標準溶液注入質譜儀中，在MS Scan模式下，得到母離子相應碎片，在Daughter Scan模式下，得到子離子相應的碎片；在MSMS模式下，優化錐孔電壓和碰撞能量，優化后的母離子、子離子、碰撞電壓及錐孔電壓參數為母離子445.1m/z，子離子428.1m/z（定量離子）、154.1m/z，碰撞電壓28 V，錐孔電壓22 V。

2.3 檢測結果分析

2.3.1 曲線線性關系及儀器檢出限

以峰面積對應的濃度進行線性回歸，線性方程為y=6 226.16x-11.917 8，相關系數R2=0.998 914。根據四環素化合物的定性離子的重構色譜峰的信噪比≥3，定量離子的重構色譜峰的信噪比≥10，通過計算，得出儀器檢出限為 1 μg·kg-1，儀器定量限為 5 μg·kg-1。

2.3.2 回收率及精密度

分別取17-F701蝦粉、17-T228蝦粉樣品各3.00 g，在樣品中分別添加0.1 mg·L-1四環素標準物質使用液1.00 mL，按照上述方法操作上機測定，計算6組濃度的回收率及精密度，結果見表1。

表1 方法回收率及精密度結果表

2.3.3 樣品與加標回收色譜圖

分別將處理好的樣品與加標樣品在上述條件下進行測定，得到樣品與加標回收色譜圖，見圖1。

圖1 樣品與加標回收色譜圖

2.4 數據分析

蝦粉樣在考慮回收率的情況下，計算出17-F701蝦粉樣四環素含量為94.0 μg·kg-1，17-T228蝦粉樣四環素含量為124.0 μg·kg-1，對17-F701蝦粉樣做重復性實驗，相對標準偏差為5.8%。對17-T228蝦粉樣做重復性實驗，相對標準偏差為9.4%。

3 結論

通過此次能力驗證，本實驗室充分利用現有資源，按照《動物源性食品中四環素類獸藥殘留量檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法與高效液相色譜法》（GB/T 21317—2007）進行處理，并對前處理方法、色譜質譜條件進行優化，最終選擇0.2 mL·min-1的流速、柱溫35 ℃、WATERS UPLC C8-3（100 mm×2.1 mm，5 μm）色譜柱為最佳色譜分離條件。配制不同濃度四環素標準溶液上機測試，并求出回歸方程，線性良好，R2=0.998 914。對比空白蝦樣和添加四環素的蝦樣，差異明顯，對回收率和精密度進行分析，回收率為85%～103%，相對標準偏差為5.8%～9.4%。能力驗證顯示17-F701蝦粉樣品Z值為+1.1，17-T228蝦粉樣品Z值為+0.8，均達到滿意結果。實驗結果表明，優化后該方法可以達到準確的分析效果，更加節約檢測時間和檢測成本，適用于蝦中四環素類藥物的測定。