ELISA 法測定麩質過敏原及其不確定度的評估

◎ 楊 琳，王 震

（諾安實力可商品檢驗（上海）有限公司，上海 201112）

食物過敏是由人體免疫系統對食物中特定蛋白質的反應引起的敏感性。目前有＞6%的幼兒和3%～4%的成年人存在食物過敏現象。在過敏的個體中，特定的食物蛋白質會被免疫系統誤認為是有害的，當過敏個體第一次接觸到這種蛋白質時，身體的免疫系統會產生稱為免疫球蛋白E（IgE）的抗體，當過敏個體再次暴露于相同的食物蛋白質時，IgE抗體和化學物質（如組胺）就會釋放出來。組胺是一種強大的化學物質，可引起呼吸系統、胃腸道、皮膚或心血管系統的反應。在極端情況下，食物過敏甚至可能致命。盡管任何食物都能激發過敏個體的免疫反應，但只有少數食物是導致食物過敏的原因。

近幾年的普查結果顯示我國的乳糜瀉發生率為1‰～3‰，而歐洲人和澳洲人乳糜瀉的發生率則更高，為3‰～4‰。導致乳糜瀉的主要原因是長期食用含麩質的谷物，包括小麥、黑麥、大麥、燕麥、斯佩爾特小麥、卡姆小麥或其雜交品系及其制品。因此食品制造商通過在產品上清楚地貼上成分清單來保護那些對食品過敏的人。這個在歐洲食品標示中為強制規定，澳洲相關法規更是規定麩質含量大于＞20 mg·kg-1的食品，必須強制在食品上申明[1-2]。所以過敏原的檢測可確保食品制造商在制造之前及期間，具有潛在危險的過敏成分不會進入食品中。

現階段過敏原的檢測有酶聯免疫吸附分析（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、側向流動（Lateral Flow Testing，LFT）、聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）和液相色譜-質譜/質譜聯用（LC-MS/MS）幾種方法。其中LC-MS/MS設備相對昂貴；與ELISA相比，PCR的主要缺點是不針對過敏蛋白，針對DNA，而DNA的檢測并不意味著過敏蛋白的存在，且PCR只能定性測試，無法進行定量測試；側向流動僅為定性測試。因此首選以及最常用的方法是用ELISA檢測。

本文使用酶聯免疫吸附分析（ELISA）的方法測試麩質過敏原。實驗選用大豆分離蛋白、薯條、淋洗水為樣品，測定樣品空白，同時使用標準品在線性最低點、中間點濃度對以上3個樣品進行3平行加標并重復2天測試，以驗證測試的定量限、重復性和重現性，以確認該方法的可行性。同時用線性最低點濃度加標的樣品含量對于整體的測試進行不確定度評估。

1 材料與方法

1.1 試劑與標準品

麩質有證標準物質，購自Sigma-Aldrich，CAS號為8002-80-0，純度85%；麩質過敏原試劑盒，購自Biofront，型號為MonoTrace Glu-EK-96；純凈水，購自哇哈哈純凈水；無水乙醇，色譜純，購自上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

本實驗用到的主要實驗設備見表1。

1.3 測試流程

稱取0.25 g經過充分研磨的食品樣品或0.25 mL液體樣品到聚丙烯離心管中。向試樣中加入10 mL預熱的萃取緩沖液（60%乙醇、焦亞硫酸鈉和谷胱甘肽），并短暫渦旋使其懸浮混勻。將裝有試樣的試管在60 ℃下培養試管1 h，每隔15 min劇烈振搖一次，以提取樣品中的蛋白質。將試樣在室溫下以2 000g離心10 min，并用樣品稀釋劑將樣品提取液稀釋10倍。取200 μL稀釋過的樣品提取液和標準品添加到相應的孔中，使樣品中的麩質抗原與包被在試劑盒微孔板中的多克隆抗體結合，并在孔中形成抗原-抗體復合物。在22 ℃孵育10 min。小心倒出測試條孔中的液體，在吸水紙上拍打至干。用洗滌緩沖液清洗3次，并每次拍打吸干，以清洗去除未結合的麩質抗原。向每個孔中添加100 μL抗麩質辣根過氧化物酶（HRP）。將其置于避光環境中，22 ℃孵育10 min，此時酶與已形成的抗原-抗體復合物結合，形成抗體-抗原-抗體夾心。小心將測試條孔中液體倒出，清洗并拍打吸干，去除多余的結合抗體。每孔添加100 μL高靈敏度3,3',5,5'-四甲基聯苯胺（TMB）底物后，22 ℃避光孵育10 min，向每個孔中添加100 μL反應終止液，輕輕振搖進行混合，以防止產生氣泡干擾吸光度讀數。由于復合物上結合了酶，導致酶底物的加入后有顏色的產生，且顏色的強度與食物中麩質的濃度成正比，所以使用裝有吸光度在450 nm的酶標儀讀取微孔的吸光度，并繪制標準曲線[3]。

1.4 實驗測量方法與數學模型

實驗測量方法為稱樣→提取→孵育→離心→稀釋→孵育→洗板→加麩質抗體共軛物→孵育→洗板→加底物→孵育→加終止液→讀數。被測量的數學模型：

式中：X為試樣中麩質過敏原的含量，mg·kg-1；C為測定用試樣液中麩質過敏原的濃度，μg·mL-1；M為試樣質量，g；V為試樣的最后定容體積，mL。

2 結果與分析

2.1 線性范圍與數據結果

取大豆分離蛋白、薯條、淋洗水空白基質樣品，取3份不加入標準品直接測試，通過3 d對空白基質的測定，得到的結果均為0 mg·kg-1，基質樣品中的數值均＜檢出限的1/3，表明基質對加標沒有干擾，這3種基質與試劑盒之間沒有交叉反應。另取樣品分別于每份樣品中加入標準曲線范圍低、中濃度的標準溶液各3份后，重復2 d，按照1.3的試驗步驟測試，標準物質曲線見圖1，基質加標數據見表2。

以標樣的濃度（μg·mL-1）為橫坐標，從儀器讀取450 nm的吸光度為縱坐標，繪制標準工作三次曲線，標準工作三次曲線的線性相關系數在2～100 μg·mL-1為R2=1，見圖1，滿足＞0.995的要求，說明線性在該定量范圍內符合標準要求[4]。各個基質最低加標水平2 mg·kg-1均能夠同時滿足精密度和準確度的要求，所以加標最低點2 mg·kg-1即為此次驗證的定量限，同時該定量限也完全能滿足20 mg·kg-1的歐盟相關法規要求。

圖1 標準物質曲線圖

通過2個濃度點的基質加標并測試2 d，計算得出2 d測試的結果，并計算其回收率，同時對方法的準確度、重復性與重現性進行驗證，結果見表2。發現不同濃度水平的回收率均能滿足70%～120%的要求，證明其準確度符合標準要求；基質2個加標水平的回收率的相對標準偏差均能滿足＜20%的要求，證明其重復性及重現性符合標準要求[4]。

表2 基質加標數據表

2.2 不確定度的來源的確定和分析

2.2.1 A類不確定度的來源

取大豆分離蛋白基質的最低點加標的6個平行測定結果計算麩質過敏原含量的相對標準不確定度urel(X)。6 次的結果分別為 1.8 mg·kg-1、1.9 mg·kg-1、1.8 mg·kg-1、2.3 mg·kg-1、2.1 mg·kg-1和 2.3 mg·kg-1，平均值為 2.03 mg·kg-1[5-6]。

麩質過敏原含量測定重復性標準不確定度為：

麩質過敏原含量測定重復性相對標準不確定度為：

2.2.2 B類不確定度來源

（1）樣品稱量m引起的不確定度urel(M)。用萬分之一電子天平進行樣品的稱量，其分度值為0.1 mg，取均勻分布，包含因子則可讀性的不確定度為天平校正產生的不確定度，按檢定證書給出的稱量誤差為±0.3 mg，假設為均勻分布，

由此2項合成得出稱量的標準不確定度為：

得出稱量引起的相對標準不確定度為urel(M)=u(M)/0.25 g=7.28×10-4。

（2）10 mL移液器移取提取液引起的不確定度urel(V)。樣品提取時加入10 mL提取液。移液器的不確定度來源于移液器產生的不確定度u(V1)和溫度效應產生的不確定度u(T)。

移液器產生的不確定度：10 mL移液器，其不確定度由SIMT校定給出擴展不確定度U=12 μL，k=2；標準不確定度為u(V1)=U/k=6 μL。

溫度效應產生的不確定度：移液器一般在20 ℃下被校準，實驗室的環境溫度一般為（20±5）℃，水的膨脹系數為2.1×10-4℃-1，按矩形分布10 mL移液器由溫度效應引入的標準不確定度為u(T)=10 000×5×2.1×10-4/則相對標準不確定度為：

（3）配制標準工作液引起的不確定度urel(std)。制備工作曲線標準溶液時，使用了1 000 μL移液槍。1 000 μL移液槍的擴展不確定度U=3.5 μL，k=2；按矩形分布，溫度效應引入的標準不確定度為1 000×5×2.1×

則相對標準不確定度為：

（4）測試用樣液體積引起的不確定度urel(V2)。吸取100 μL樣品提取液上機測試。使用100 μL移液槍，其擴展不確定度U=0.6 μL，k=2；按矩形分布，溫度效應引入的標準不確定度為100×5×2.1×10-4/

則相對標準不確定度為：

（5）酶標儀引入的不確定度urel(A)。由校準證書給出儀器擴展不確定度為吸光度U=0.06（k=2），則相對不確定度為urel(A)=0.06/2=0.03。

（6）孵育時間引入的不確定度urel(T)。實驗中共孵育3次，孵育時間均為10 min。已校準過的計時器擴展不確定度為U=1 s（k=2），則由溫育時間引入的相對標準不確定度為：

（7）孵育溫度引入的不確定度urel(W)。實驗中共孵育3次，孵育溫度均為22 ℃。已校準過的孵育箱擴展不確定度為U=0.4 ℃（k=2），則由溫育溫度引入的相對標準不確定度為：

2.2.3 計算合成相對不確定度urel(X)

合成相對不確定度urel(X)為：

2.2.4 計算擴展不確定度

在95%的置信概率下時，擴展因子k=2，則大豆分離蛋白中的麩質過敏原含量的擴展不確定度為U=2×0.058 7=11.7%。則麩質過敏原含量的測定結果可以表述為X=（2±0.234）mg·kg-1（k=2）。

2.3 不確定度評估

選取大豆分離蛋白基質的最低點加標數據作為A類不確定度的數據來源，統計測試的各個環節中所使用到的定量設備以及溫度和時間等關鍵因素作為B類不確定度的數據來源，最后合成A類與B類不確定度，從而得出一個合成擴展不確定度作為方法的不確定度U=2×0.058 7=11.7%（k=2）。

3 結論

從實驗結果可以看出采用ELISA的方法可以準確測定大豆分離蛋白、薯條、淋洗水中麩質的含量，其準確性和精密度均能符合標準要求、不確定度也能比較準確地體現該方法結果的可信賴程度、檢出限也能符合歐盟的法規要求。表明本文通過ELISA的測試方法解決了LC-MS/MS測試成本高、PCR只能測基因片段而不是測試致敏蛋白導致的假陽性問題以及PCR和側向流動技術僅為定性法的問題，因此采用該方法測試麩質過敏原是一個成本較低、定量準確的較好的選擇，不僅有利于企業對自己上市的產品進行篩查，還利于監管單位對市售產品進行監管。