UPLC-MS法測定動物源性食品中12種大環內酯類抗生素殘留量

◎ 賈琳斐，管 理，賈潤芳，尹 靜，張 鑫

(咸陽市食品藥品檢驗檢測中心，陜西 咸陽 712000)

大環內酯類藥物是一類快速抑制蛋白質合成的抑菌藥，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌具有良好的抗菌作用[1-2]。大環內酯類抗生素在臨床上常用于上呼吸道感染、泌尿道感染的治療[3-4]，少量使用能促進畜禽類的生長，故廣泛應用于獸藥領域[5]。

大環內酯類抗生素檢測方法主要有紫外分光光度法[6]、毛細管電泳-電化學法[7]、氣相色譜-串聯質譜法[8]及液相色譜-串聯質譜法[9]。其中，紫外分光光度法、毛細管電泳-電化學法、氣相色譜-串聯質譜法因靈敏度、準確度均較低及被檢樣品種類受限等原因，研究鮮有報道。目前，液相色譜-串聯質譜法為大環內酯類抗生素的主要檢測手段，前處理技術多采用QuEChERS法[10]或固相萃取法[11]，但這些方法或檢出限較高、或大環內酯類檢測種類較少。本研究選取具有代表性的12種大環內酯類抗生素，通過對提取條件、基質效應的影響進行分析，為動物源性食品中多種大環內酯類獸藥殘留的快捷、準確監測提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈，色譜純，默克公司；HLB固相萃取柱（500 mg/6 mL）、C18色譜柱（500 mg /3 mL），均為艾杰爾公司；12種大環內酯類標準品均由CATO公司提供；動物源性樣品均來自咸陽市區農貿市場及大型超市，取可食部分絞碎、混勻，-20 ℃冷凍保存。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜-串聯質譜聯用儀Qsight 210，美國PerKin Elmer公司；RV-10旋轉蒸發儀，德國IKA公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

分別稱取適量12種大環內酯類標準品于容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，得到濃度為100 μg·mL-1的大環內酯類標準儲備液，冷凍保存。分別移取適量的各單標儲備溶液，空白基質稀釋，配制成大環內酯類標準工作液。

1.3.2 樣品處理

提取：稱取均質后的試樣5 g，于50 mL塑料離心管中，加入20 mL 1%酸化乙腈，渦旋1 min，超聲5 min，5 000 r·min-1離心6 min，取上清液轉移至另一離心管中，殘渣再加15 mL乙腈，重復提取一次，合并上清液，備用。凈化：預先用5 mL乙腈活化HLB固相萃取柱，上清液過柱，收集洗脫液，加入異丙醇4 mL，40 ℃蒸發至干；加入2 mL乙腈乙酸銨（1∶4）溶解殘余物，加乙腈飽和正己烷2 mL，轉至離心管中，旋渦 10 s，5 000 r·min-1離心 5 min，取下層清液過0.22 μm濾膜，上機測定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），柱溫：40 ℃；進樣體積：5 μL；流速：0.3 mL·min-1；流動相：A為5 mmol·L-1乙酸銨，B為0.1%甲酸乙腈；梯度洗脫：0～2 min，A∶B為95∶5；2～5 min，A∶B為 50∶ 50；5～ 6 min，A∶B為5∶ 95；6～8 min，A∶B為5∶95；8.0～8.3 min，A∶B為95∶5；8.3～11.0 min保持95∶5。

1.3.4 質譜條件

電噴霧離子源正離子模式，多反應監測（Multiple Reaction Monitoring，MRM），干燥器流速：100 μL·min-1；脫溶劑氣溫度：300 ℃；霧化器流速：200 μL·min-1；離子源噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：300 ℃。

2 結果與分析

2.1 提取條件的優化

為提高提取效率，本研究比較了乙腈、1%酸化乙腈、乙腈-乙酸乙酯（體積比1∶1）對動物源食品中大環內酯類抗生素藥物殘留的提取效果，圖1結果表明，采用乙腈、乙腈-乙酸乙酯（體積比1∶1）提取液提取目標物質后回收率較低，回收率在20%～60%；1%酸化乙腈對12種大環內酯類抗生素的提取效率最高，回收率均在60%以上。

圖1 3種溶劑對12種化合物回收率的影響圖

2.2 基質效應的評價與消除

對于動物源性等較復雜樣品，基質效應影響樣品測定的準確性。因此，在樣品測定時應建立基質效應（Matrix Effect，ME）的評價，一般較為簡單的評價方法為相對響應值法，A為空白樣品基質中添加的相同含量標準物質的響應值，B為純溶劑中標準物質的響應值，ME=A/B×100%，當ME＜1.0時，則存在基質抑制效應；當ME＞1.0時，則存在基質增強效應[12]。表1實驗結果表明，12種化合物在3種不同基質中的基質效應在0.16～1.31。其中，3種基質對交沙霉素，雞肉對克拉霉素、林可霉素均無明顯的基質效應（ME=1±0.1）；豬肉對克拉霉素、林可霉素均有基質增強效應，3種基質對其余化合物均有基質抑制作用。

表1 12種大環內酯類在不同基質中的基質效應評價表

消除基質效應的方法包括改進前處理凈化方法、同位素內標法、基質配制標準曲線法，綜合考慮，本研究采用基質配制標準曲線法，能夠很好地消除基質效應，滿足殘留物的檢測。

2.3 檢出限與定量下限

采用空白樣品配制與待測樣品相同基質的系列標準溶液，濃度分別為 2 ng·mL-1、4 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、40 ng·mL-1、50 ng·mL-1、80 ng·mL-1和100 ng·mL-1，以色譜峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪制工作曲線，外標法定量。結果顯示，各化合物均在2～100 ng·mL-1濃度線性關系良好，相關系數（r2）均大于0.99。以3倍的信噪比確定檢出限，10倍的信噪比確定定量下限，得到12種大環內酯類化合物的檢出限均為 0.1 μg·kg-1，定量下限均為 0.3 μg·kg-1。

2.4 回收率與精密度

準確稱取陰性試樣豬肉、雞肉、牛肉并按照1.3.2的樣品前處理方法進行回收率及精密度的考察。向其中加入 0.3 μg·kg-1、0.6 μg·kg-1、3.0 μg·kg-13 種不同濃度進行3個梯度加標水平的回收率測定，每個添加水平測6個平行樣品。基質空白標準曲線進行定量測定，計算平均回收率和精密度，結果見表2。12種抗生素的平均回收率為69.2%～105.3%，相對標準偏差均在9.5%以內。該方法精密度、回收率均滿足痕量實驗分析要求。

表2 12種大環內酯類抗生素的加標平均回收率及精密度表

2.5 實際樣品的分析

應用本方法對咸陽市區大型超市、農貿市場抽檢的豬肉、雞肉、牛肉各20批進行檢測，結果顯示，1批次豬肉檢出紅霉素，殘留量為8.2 μg·kg-1，其余樣品均未檢出上述12種大環內酯類抗生素殘留物。

3 結論

本研究通過對提取條件的優化、基質效應的影響分析，建立了超高效液相-串聯質譜聯用儀檢測動物源性食品中的12種大環內酯類抗生素殘留量的方法；得到12種大環內酯類化合物的檢出限均為0.1 μg·kg-1及定量下限均為0.3 μg·kg-1。12種抗生素的平均回收率為69.2%～105.3%，精密度均在9.5%以內。本方法易操作，準確度高，重復性好，滿足批量檢測動物源性食品中的大環內酯類抗生素的需求。