嬰幼兒配方乳粉中泛酸檢測國家標準微生物法與試劑盒法比對探究

◎ 孫叢叢，李 鵬，李玉平，張天博

（河北三元食品有限公司，河北 石家莊 050700）

泛酸又稱維生素B5，是一種水溶性維生素，化學式為C9H17NO5，因以輔酶A（CoA）和酰基載體蛋白（ACP）這種結合態形式廣泛存在于動植物中而得“泛酸”之名[1]。泛酸純品為淡黃色油狀物，具有酸性，易溶于水及乙醇，不溶于脂溶劑；在酸性溶液中易分解，在中性溶液中較為穩定[2-4]。

經文獻報道，泛酸的檢測方法有間接競爭酶聯免疫法、液相色譜-質譜聯用法、超高效液相色譜-同位素稀釋質譜法、毛細管等速電泳法以及氣相色譜-質譜聯用法等[5-9]。目前，《食品安全國家標準 食品中泛酸的測定》（GB 5009.210—2016）中規定，食品中泛酸的檢測方法有微生物法和高效液相色譜法，各企業使用微生物法檢測泛酸還可分為國家標準微生物法和試劑盒法。

高效液相色譜法利用泛酸的化學性質，即泛酸易溶于水，在弱酸性至中性條件下（pH為5.0～7.0）穩定，樣品經超聲提取后，經C18反相色譜柱分離，在紫外檢測器200 nm波長處測定，通過對色譜峰的保留時間和紫外光譜圖定性，利用外標法定量，可計算樣品中泛酸的含量。但該方法不適于含水解蛋白乳粉樣品檢測，而且需要的儀器成本和維護成本投入較大[10]。傳統微生物法是利用植物乳桿菌生長需要泛酸，泛酸含量與植物乳桿菌生長吸光度成線性關系，通過對植物乳桿菌吸光度的測定，可計算出待測樣品中泛酸的含量。此檢測方法需要提前活化菌株，洗菌制備接種菌懸液，樣品前處理提取過程至少4 h，接種前需要對標準系列管和試樣管進行高壓滅菌，檢測過程比較復雜，對人員和環境設施要求高，檢測周期長。試劑盒法與傳統微生物法原理相同，但其采用了一種新型的微孔板反應體系，使用方便，不需要活化菌株，標準溶液配制簡單，可實現快速檢測，而且靈敏度高，特異性好，重復性好，可在各企業內廣泛使用。

《嬰幼兒配方乳粉生產許可審查細則（2013版）》中明確規定，企業可以使用快速檢驗設備，但應保持檢測結果準確。企業使用的快速檢測方法及設備應定期與食品安全國家標準規定的檢驗方法進行比對或驗證。因此，本文采用國家標準微生物法與試劑盒法檢測嬰幼兒配方乳粉中的泛酸含量，并對兩種方法進行比對，以期為相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

5種嬰幼兒配方乳粉，均購自河北三元食品有限公司；質控樣品QC-IP-705（2021），購于中國檢驗檢疫科學研究院；試劑盒，購于北京陸橋技術股份有限公司。

1.1.2 標準菌株

植物乳桿菌（ATCC 8014），美國Microbiologics公司。

1.1.3 培養基及試劑

（1）培養基。乳桿菌肉湯培養基、菌株儲存用瓊脂培養基、泛酸測定培養基，購于北京陸橋技術股份有限公司。

（2）試劑。冰乙酸（天津市河東區紅巖試劑廠）、三水合乙酸鈉（天津市永大化學試劑有限公司）、乙醇（天津市光復科技發展有限公司）。

（3）標準品。D-酸鈣（C18H32CaN2O10），純度99.8%，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

ME204分析天平（梅特勒托利多有限公司）；KQ5200DE超聲振蕩器（昆山市超聲儀器公司）；SW-CJ-2FD超凈工作臺（上海新苗醫療器械公司）；DNP-9272BS-Ⅲ電熱恒溫培養箱（上海新苗醫療器械公司）；YXQ-LS-100A壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司）；Vortex Genie2渦旋混勻器（美國Vortex）；TD5M-WS離心機（上海盧湘儀儀器有限公司）；T9S紫外分光光度計（北京普析通用儀器公司）；Multiskan FC酶標儀、移液器（美國熱電）。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

國家標準微生物法參照《食品安全國家標準 食品中泛酸的測定》（GB 5009.210—2016），稱取樣品后加入80 mL 20%乙醇溶液，具塞，超聲振搖提取4 h以上至試樣完全溶解，用水定容至100 mL，適當稀釋。試劑盒法是加入20 mL樣品提取稀釋液后，95 ℃水浴加熱30 min，迅速冷卻，無菌濾膜過濾，再進行適當稀釋。

1.3.2 標準溶液配制

根據《食品安全國家標準 食品中泛酸的測定》（GB 5009.210—2016）和試劑盒說明書分別制備標準溶液。具體見表1、表2。為保證標準曲線的線性關系，應制備2～3套標準系列管，繪制標準曲線時，以每個標準點的均值計算。

表1 國家標準微生物法標準溶液制備表

表2 試劑盒法標準溶液制備表

1.3.3 菌懸液制備

國家標準微生物法需要活化菌株，挑取單菌落至種子培養液，（37±1）℃培養20～24 h后，3 000 r·min-1，離心10 min，棄去上清液，用0.9%無菌生理鹽水重復洗菌2次（3 000 r·min-1，離心10 min）后，棄去上清液，復溶，制成接種液。試劑盒法直接使用套裝菌球即可。

1.3.4 標準系列管及樣品管制備

國家標準微生物法標準系列管按照表1制備，最后每管加入5 mL泛酸測定用培養基。樣品系列管制備見表3。

表3 樣品系列管制備表

各系列管制備完成后，需要于121 ℃滅菌15 min，之后迅速冷卻至室溫。無菌條件下，每管加入50 μL接種液，另準備一支標準0管（含0 ng泛酸）不接種，作為0對照管。

1.3.5 接種與培養

試劑盒法采用點板操作，套裝內干粉培養基與10 mL無菌水混合后，于95 ℃水浴加熱10 min，迅速冷卻，經無菌濾膜過濾，加入標準菌球，混勻。微孔板內先點培養基，每孔100 μL，再點標準品溶液/樣品稀釋液，每孔100 μL。

國家標準微生物法培養條件為（37±1）℃恒溫培養箱中培養16～20 h。試劑盒法為（36±1）℃，避光培養44～48 h。

1.3.6 吸光度測定

國家標準微生物法使用紫外分光光度計，于550 nm處，以未接種的0對照管調節吸光度值為0，依次測定標準系列管、試樣系列管的吸光度值。試劑盒法使用酶標儀，于550 nm處，測定標準溶液和各樣品溶液吸光度值。

1.3.7 泛酸含量計算

國家標準微生物法試樣稀釋液中泛酸濃度按式（1）計算：

式中：ρ為試樣稀釋液中泛酸濃度，ng·mL-1；ρx為從標準曲線上查得測定系列管中泛酸含量，ng；Vx為制備試樣系列管時吸取的試樣稀釋液體積，mL。

國家標準微生物法待測液中泛酸含量按式（2）計算：

式中：X為試樣中泛酸含量，固態試樣，mg/100 g；為試樣稀釋液泛酸濃度平均值，ng·mL-1；V1為試樣提取液的定容體積，mL；F為試樣提取液稀釋倍數；m為試樣質量，g；為換算系數。

試劑盒法待測液中泛酸含量按式（3）計算：

式中：X為樣品中泛酸濃度， μg/100 g（ μg/100 mL）；C為標準曲線上讀取的濃度，μg/100 g；F為稀釋倍數（不考慮熱提取時稀釋的20倍）；m為樣品質量，g。

2 結果與分析

2.1 標準曲線制作

以標準系列管泛酸含量為橫坐標，每個標準點吸光度值均值為縱坐標，使用ELISA專業統計分析軟件中4-Parameyer繪制標準曲線。國家標準微生物法和試劑盒法標準曲線如圖1、圖2所示。國家標準微生物法標準曲線相關系數為0.992 8，試劑盒法標準曲線相關系數為0.994 3，兩種方法線性關系均良好。

圖1 國家標準微生物法泛酸測定標準曲線圖

圖2 試劑盒法泛酸測定標準曲線圖

2.2 重復性實驗結果

國家標準微生物法和試劑盒法分別對6個樣品測定，每個樣品重復測定6次，檢測結果見表4、表5。國家標準微生物法重復性測定RSD值為1.16%～2.43%，試劑盒法重復性測定RSD值為1.14%～2.29%，兩種方法重復性均良好，且質控樣品檢測數據與理論真值（3.955 mg/100 g）接近，準確度較高。

表4 國家標準微生物法重復性測定結果表

表5 試劑盒法重復性測定結果表

2.3 方法差異比較

采用配對樣品t檢驗，對兩種檢測方法的結果進行分析，t值為0.602，sig值為0.573（p＞0.05），表明國家標準微生物法和試劑盒法檢測泛酸含量無顯著差異，因此試劑盒法可以應用于嬰幼兒食品中泛酸的測定。

3 討論

與國家標準微生物法相比，試劑盒法主要有以下優勢。①菌株活化方面，不需要提前活化菌株，縮短了檢測周期。②耗材使用方面，不需要大量試管、三角瓶、容量瓶等玻璃器皿，可省去清洗、沸水浴煮、高溫干燥滅菌等處理工序。③標準溶液配制直接配制工作液即可，線性范圍更寬，適于高含量泛酸樣品檢測。④樣品前處理時間短，方便快捷。⑤樣品吸光度值測定采用96孔板，使用酶標儀測定，一次性讀取數據，快速、高效。因此，試劑盒法更適于企業實驗室大量實驗樣本的檢測。

4 展望

實驗室可通過探究凍干菌球復溶菌懸液濃度，配制不同濃度泛酸標準溶液，使用96微孔板，對泛酸進行測定，這樣可省去試劑盒檢測費用，為企業節約檢測成本。另外，通過調試菌懸液濃度與樣品稀釋液稀釋度，通過優化其最佳配比，有可能縮短微孔板培養時間，進而縮短檢測周期。