TTC應(yīng)用于固體食品菌落總數(shù)測(cè)定研究

◎ 胡海燕

（好麗友食品（上海）有限公司，上海 201707）

固體食品如糕點(diǎn)類、餅干類及膨化類等產(chǎn)品按照國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)菌落總數(shù)時(shí)，稀釋后的樣品勻液中含有較多小顆粒樣品料渣或者白色油脂顆粒不能完全溶解，此樣品料渣在結(jié)果計(jì)數(shù)時(shí)呈現(xiàn)和乳白色菌落相似狀態(tài)，可能會(huì)被誤讀為菌落，對(duì)菌落計(jì)數(shù)有一定的干擾，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

紅四氮唑，化學(xué)名為2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-trihenylterzoliumchloride，TTC），分子式為C19H15ClN4，是一種脂溶性光敏感復(fù)合物。TTC水溶液無色，能被嗜中溫性需氧菌在新陳代謝過程中產(chǎn)生的琥珀脫氫酶的氫結(jié)合產(chǎn)生紅色的三苯甲臢（TPF），因此使菌落呈現(xiàn)紅色，與樣品的白色料渣明顯區(qū)分，使菌落總數(shù)計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性提高[1-2]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑

紅四氮唑（TTC）：分析純，上海展云化工有限公司；菌落計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；食鹽：中鹽上海市鹽業(yè)公司；標(biāo)準(zhǔn)菌株：ACAS-PT1080，中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心。

1.2 試驗(yàn)儀器

AND-EK6100i電子秤；interscience BAGMIXER400均質(zhì)器；超凈工作臺(tái)：蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司；GR85DA滅菌鍋：致微（廈門）儀器有限公司；PALL過濾除菌膜：0.2 μm；賽多利斯電子單道移液器；上海博迅隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱；GZX-9240MBE博迅電熱鼓風(fēng)干燥箱。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 TTC制備

稱取1.0 g TTC溶解于100 mL無菌的蒸餾水中，使用0.2 μm的濾膜過濾除菌后置于經(jīng)過121 ℃、15 min高壓蒸汽滅菌的玻璃瓶?jī)?nèi)，瓶外包裹錫箔紙避光保存，使用時(shí)按照所需配制成適宜的濃度進(jìn)行試驗(yàn)[3]。

1.3.2 試驗(yàn)試劑的制備

菌落計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）：稱取23.5 g培養(yǎng)基于1 L蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，121 ℃高壓滅菌15 min，冷卻至46 ℃左右備用[4]。

0.85%生理鹽水：稱取8.5 g食鹽于1 L蒸餾水中，完全溶解，121 ℃高壓滅菌15 min，冷卻至常溫備用[5]。

1.3.3 TTC顯色特征分析

已接種固定濃度細(xì)菌的奶粉和0.85%生理鹽水制成菌懸液，將菌懸液按照10倍稀釋，用均質(zhì)器拍打2 min制成樣品勻液，然后按照1∶10、1∶100進(jìn)行梯度稀釋，每個(gè)梯度做2個(gè)平行，共做8組，最后分別用含有0%、0.000 4%、0.001 0%、0.002 0%、0.004 0%和0.008 0%TTC的菌落計(jì)數(shù)瓊脂傾注平板，凝固后倒置于（36±1）℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)。

1.4 TTC使用濃度分析

1.4.1 不同濃度TTC應(yīng)用于糕點(diǎn)類產(chǎn)品的菌落總數(shù)檢測(cè)

分別準(zhǔn)備含有不同菌量的糕點(diǎn)類制品，即糕點(diǎn)1、糕點(diǎn)2和糕點(diǎn)3。將以上樣品均按照10倍稀釋溶解，用均質(zhì)器拍打2 min制成樣品勻液，然后分別按照梯度稀釋1∶10、1∶100進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)樣品及試驗(yàn)梯度做兩個(gè)平行。最后分別用不含TTC的PCA和分別含有0.000 1%、0.000 5%、0.001 0%、0.001 5%和0.002 0%TTC的PCA培養(yǎng)基進(jìn)行傾注平板，待平板凝固后倒置于細(xì)菌培養(yǎng)箱內(nèi)，（36±1）℃下培養(yǎng)24 h，對(duì)平板上菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)[6]。

1.4.2 不同濃度TTC應(yīng)用于餅干制品的菌落總數(shù)檢測(cè)

分別準(zhǔn)備含有不同餅干類制品，即餅干1、餅干2和餅干3。將以上樣品均按照10倍稀釋溶解，用均質(zhì)器拍打2 min制成樣品勻液，然后分別按照梯度稀釋1∶10、1∶100、1∶1 000進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)樣品及試驗(yàn)梯度做2個(gè)平行。最后分別用不含TTC的PCA和分別含有0.000 1%、0.000 5%、0.001 0%、0.001 5%和0.002 0%TTC的PCA培養(yǎng)基進(jìn)行傾注平板，待平板凝固后倒置于細(xì)菌培養(yǎng)箱內(nèi)，（36±1）℃下培養(yǎng)24 h，對(duì)平板上菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)[6]。

1.4.3 TTC最佳使用濃度分析

配制不同濃度的菌懸液3份，分別使用未添加TTC和添加了0.001%、0.002%、0.003%、0.004%和0.005%的菌落計(jì)數(shù)瓊脂進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)每個(gè)樣品的結(jié)果進(jìn)行分析，選擇TTC的最佳使用濃度。

1.5 TTC應(yīng)用于不同類型產(chǎn)品菌落總數(shù)檢測(cè)

分別準(zhǔn)備含有不同菌量的糕點(diǎn)產(chǎn)品、餅干產(chǎn)品。將以上樣品均按照10倍稀釋溶解，用均質(zhì)器拍打2 min制成樣品勻液，然后分別按照梯度稀釋1∶10、1∶100進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)樣品及試驗(yàn)梯度做2個(gè)平行。最后分別用不含TTC的PCA和含有0.001%TTC的PCA培養(yǎng)基進(jìn)行傾注平板，待平板凝固后倒置于細(xì)菌培養(yǎng)箱內(nèi)，（36±1）℃下培養(yǎng)24 h，對(duì)平板上菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，并觀察菌落形態(tài)。

為驗(yàn)證TTC添加使用時(shí)結(jié)果檢測(cè)的準(zhǔn)確性，對(duì)菌落總數(shù)檢測(cè)是否具有抑菌效果，采用中國檢科院測(cè)試評(píng)價(jià)中心提供的能力驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)菌進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)菌用0.85%生理鹽水稀釋后采用1∶10、1∶100、1∶1 000等梯度稀釋，最后分別傾注不含TTC和含有0.001%TTC的PCA培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，待樣品凝固后倒置于細(xì)菌培養(yǎng)箱，（36±1）℃下培養(yǎng)24 h，對(duì)平板上菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，并觀察菌落形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TTC顯色特征分析

未添加TTC的平板上菌落呈現(xiàn)白色至淡黃色，奶溶液中的菌落呈蔓延狀態(tài)，無論是奶溶液還是生理鹽水中，菌落顏色隨著菌落計(jì)數(shù)瓊脂中TTC的濃度增加，逐漸由淡紅色變?yōu)樯罴t色；隨著添加濃度的增加，顯色效果越明顯，使菌落更易辨認(rèn)，如圖1、圖2所示。

圖1 菌落在奶粉中不同濃度TTC顯色狀態(tài)圖

圖2 菌落在生理鹽水中不同濃度TTC顯色狀態(tài)圖

2.2 TTC使用濃度分析

3個(gè)糕點(diǎn)樣品和3個(gè)餅干樣品菌落總數(shù)結(jié)果均顯示，未添加TTC和添加0.000 1%TTC的檢測(cè)結(jié)果偏低，而添加0.001 0%～0.002 0%TTC的檢測(cè)結(jié)果明顯偏高，如表1所示。

表1 不同樣品添加不同濃度TTC檢測(cè)結(jié)果對(duì)比表（單位：CFU·g-1）

通過平板對(duì)比得到，未添加TTC的菌落形態(tài)和樣品料渣極為接近，計(jì)數(shù)時(shí)易漏讀或誤把料渣計(jì)為菌落，尤其餅干類樣品菌落蔓延較大，影響計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。添加0.000 1%TTC的平板菌落亦呈白色，隨著TTC添加濃度的增加，菌落由粉紅色逐漸顯色至深紅色，和白色的產(chǎn)品料渣形成鮮明對(duì)比，較易區(qū)分，如圖3所示；餅干類樣品隨著TTC添加濃度的增加，菌落蔓延現(xiàn)象逐漸減少，菌落呈現(xiàn)清晰的紅色狀態(tài)，極易區(qū)分和計(jì)數(shù)，如圖4所示。

圖3 糕點(diǎn)樣品添加不同濃度TTC菌落形態(tài)對(duì)比圖

圖4 餅干樣品添加不同濃度TTC菌落形態(tài)對(duì)比圖

由不同TTC濃度檢測(cè)結(jié)果可得，當(dāng)添加濃度低于0.001 0%時(shí)菌落亦蔓延，菌落顯色不佳，不便于計(jì)數(shù)，而當(dāng)TTC濃度為0.001 0%～0.002 0%時(shí)菌落顯色明顯，便于計(jì)數(shù)，且對(duì)菌落的生長(zhǎng)無明顯抑制作用。

由TTC最佳使用濃度分析試驗(yàn)可得，不添加TTC時(shí)，菌落蔓延明顯，菌落有重疊現(xiàn)象，檢測(cè)結(jié)果明顯低于添加TTC；而TTC的添加量為0.001%～0.003%時(shí)，檢測(cè)結(jié)果較為穩(wěn)定，但TTC添加量為0.004%～0.005%時(shí)，檢測(cè)結(jié)果明顯偏低，如圖5所示。說明當(dāng)TTC添加濃度≤0.003%時(shí)，對(duì)菌落總數(shù)檢測(cè)無抑菌作用，當(dāng)添加濃度≥0.004%時(shí)有明顯的抑菌作用。

圖5 不同濃度TTC下菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果圖

2.3 TTC應(yīng)用于不同類型產(chǎn)品菌落總數(shù)檢測(cè)

如圖6、圖7所示，糕點(diǎn)產(chǎn)品或餅干產(chǎn)品稀釋后均存在不同顆粒度的料渣或者油脂，培養(yǎng)后的菌落一般呈現(xiàn)白色或淡黃色，和部分料渣極為相似，菌落計(jì)數(shù)瓊脂中未添加TTC時(shí)，不易區(qū)分料渣顆粒和菌落，導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果偏低，而使用添加0.001%的TTC作為顯色劑時(shí)，能明顯區(qū)分紅色菌落，使菌落計(jì)數(shù)準(zhǔn)確度更高。對(duì)比添加與未添加顯色劑的樣品菌落總數(shù)來看，含有樣品渣的固體檢樣添加TTC顯色劑后，檢測(cè)結(jié)果明顯偏高，而未添加TTC的檢測(cè)結(jié)果偏低。同時(shí)，用標(biāo)準(zhǔn)菌樣本對(duì)含有0.001%TTC的顯色能力進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)添加0.001%TTC對(duì)結(jié)果無明顯抑制作用，如表2所示。

表2 不同樣品不添加TTC和添加TTC檢測(cè)結(jié)果對(duì)比表

圖6 糕點(diǎn)樣品未添加TTC和添加TTC對(duì)比圖

圖7 餅干產(chǎn)品未添加TTC和添加TTC對(duì)比圖

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

對(duì)TTC的顯色特性進(jìn)行分析，TTC可以使活菌菌落呈現(xiàn)紅色，且添加濃度越高，菌落紅色越明顯，且能有效抑制菌落蔓延。

使用不同濃度TTC檢測(cè)糕點(diǎn)、餅干樣品菌落總數(shù)時(shí)，由于菌落呈紅色，與產(chǎn)品白色或淡黃色料渣對(duì)比鮮明，相比不含TTC的培養(yǎng)基，菌落計(jì)數(shù)更加方便，當(dāng)TTC使用濃度＜0.001 0%時(shí)菌落偏小，且易蔓延，不便于計(jì)數(shù)，但使用濃度0.001 0%～0.002 0%時(shí)，菌落形態(tài)偏大，能有效減少蔓延菌落。故0.001 0%～0.002 0%的TTC添加量使用于固體樣品的檢測(cè)，能顯著區(qū)分菌落和料渣，避免誤讀，提高菌落總數(shù)檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

在固體樣品，如糕點(diǎn)、膨化及餅干樣品檢測(cè)中，有明顯料渣或油脂顆粒的菌落總數(shù)檢測(cè)中，TTC的使用可以明顯區(qū)分菌落和料渣。同時(shí)，在用標(biāo)準(zhǔn)菌進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)得到，添加使用0.001%的TTC，對(duì)菌落總數(shù)檢測(cè)無抑制作用，即在該濃度下菌落能夠很好地顯色，同時(shí)又不會(huì)對(duì)菌落總數(shù)產(chǎn)生顯著性的差異；通過進(jìn)一步使用濃度分析得到，TTC添加量≤0.003%時(shí)，對(duì)菌落總數(shù)的檢測(cè)無影響。

3.2 應(yīng)用與探討

使用TTC時(shí)，明顯看出在糕點(diǎn)產(chǎn)品檢測(cè)時(shí)較少蔓延現(xiàn)象，而在餅干檢測(cè)中較多蔓延菌落，因此TTC在糕點(diǎn)類產(chǎn)品和餅干類產(chǎn)品中的抑菌效果是否相同需要進(jìn)一步分析。TTC應(yīng)用于不同樣品的檢測(cè)，如水、環(huán)境涂抹檢測(cè)、調(diào)味料等呈現(xiàn)的菌落形態(tài)均不同，在水中菌落生長(zhǎng)慢，即使添加TTC，培養(yǎng)48 h菌落較小；而環(huán)境涂抹中部分菌落無法被TTC染色，故不同菌落在使用TTC顯色時(shí)呈現(xiàn)不同狀態(tài)，需要進(jìn)一步分析研究。