西紅花根際可培養細菌菌群結構、多樣性及分布規律

張家豪，陸潔淼，丁鈺婷，秦路平，朱 波

西紅花根際可培養細菌菌群結構、多樣性及分布規律

張家豪，陸潔淼，丁鈺婷，秦路平*，朱 波*

浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 311402

探討西紅花根際可培養細菌菌群結構及其分布規律。收集浙江建德、上海崇明、陜西澄城西紅花球莖根際土，用傳統涂布法分離根際細菌，分析根際細菌菌群結構、多樣性及其與球莖生長性狀、土壤理化因子間的相關性。共分離得到西紅花根際細菌2450株，劃分為65個分類單元，歸屬到4個門，6個綱，17個科，28個屬，31種；其中最優勢門為厚壁菌門（Firmicutes，相對頻率為66.76%），最優勢屬為芽孢桿菌屬（相對頻率為57.71%）；產地和土壤理化因子影響西紅花根際細菌多樣性和菌群結構，陜西澄城2根際細菌多樣性指數最高（′＝2.590 1），土壤有效磷含量與多樣性指數呈最大正相關（＝0.910，＜0.05）；有機質與蒼白桿菌屬分離頻率呈最大負相關（＝?0.956，＜0.01）；球莖縱徑與菌群多樣性指數顯著相關（＝?0.806，＜0.05）；球莖鮮質量與根際細菌菌群結構顯著相關，其中球莖鮮質量與芽孢桿菌屬分離頻率呈最大正相關（＝0.793，＜0.05）。西紅花根際可培養細菌資源豐富，產地土壤理化因子、球莖鮮質量與西紅花根際細菌菌群結構和多樣性顯著相關，高豐度芽孢桿菌屬可能對西紅花球莖生長起有益作用。

西紅花；根際細菌；菌群結構；多樣性；土壤理化因子

西紅花系鳶尾科番紅花屬植物西紅花L.的干燥柱頭，具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神的功效，可用于經閉癥瘕、產后瘀阻、溫毒發斑、憂郁痞悶、驚悸發狂[1]?，F代藥理學研究表明西紅花具有抗血栓、抗抑郁、抗阿爾茨海默病等作用，臨床效果顯著[2-4]。

西紅花植株是三倍體不育植株[5]，只能通過西紅花球莖無性繁殖，一個西紅花球莖只能開4～6朵花，每采收110 000～170 000朵花才能收獲1 kg干燥的西紅花柱頭[6]，產量極低，大量依賴進口。西紅花球莖地下生長物候期為每年11月至笠年5月，因此根際微生物對西紅花球莖生長發育至關重要。已有研究表明，根際細菌可以通過產生生長素、固氮、溶磷等作用[7-9]，促進植物的生長、發育和代謝[10]，韓麗珍等[11]發現根際細菌sp. P5 灌根可以增加花生幼苗鮮質量35.12%。此外，根際細菌多樣性和菌群結構的改變可以影響宿主抗病性、抗非生物脅迫能力、生長和品質[12-15]，Hou等[14]研究發現根際施以67種核心菌群可以促進擬南芥在弱光條件下生長但不增強其抗病性，施以116種其他菌群增強了擬南芥的抗病性但不調控其生長，表明根際不同菌群結構的功能具有差異。分析根際微生物多樣性和菌群結構與功能的關系對開發微生物資源，保護藥用植物資源具有長遠意義。

本研究以西紅花根際土為研究對象，對西紅花根際細菌進行分離、純化與鑒定，探討菌群結構與多樣性，分析其與產地、球莖大小的相關性，為后續篩選功能菌株菌群提供參考依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

西紅花球莖采自浙江省建德市、上海市崇明區、陜西省澄城縣，各2組，分別編號1、2。經浙江中醫藥大學張巧艷教授鑒定為鳶尾科番紅花L.的球莖。

1.2 試劑與儀器

細菌基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]；2×Taq Mix（＋Dye）（莫納生物科技有限公司）；Regular Agarose G-10（BIOWEST，基因有限公司）；DL2 000 DNA Marker [寶日醫生物技術（北京）有限公司]。FA2204B型萬分之一電子天平（上海天美天平儀器有限公司）；YP10002型電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；YXQ-LS-75S II型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實業有限公司）；LM I-100型霉菌培養箱（上海龍躍儀器設備有限公司）；MC-100B型立式恒溫搖床（上海牟測儀器科技有限公司）；GenoSens 1850型凝膠成像分析系統（上海勤翔科學儀器有限公司）；1300 Series A2型生物安全柜（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Veriti 96 Well Thermal Cycler型PCR儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Centrifuge 5427R型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；F-500型火焰光度計（上海元析儀器有限公司）；SpectraMax 190型全波長酶標儀（美國Molecular Devices公司）。

2 方法

2.1 土壤理化因子測定

按照吳恙等[16]的方法，取西紅花球莖根際土。水土比5∶2，以水為浸提劑，采用pH計測定土壤pH；采用重鉻酸鉀容量法測定土壤有機質含量[17]；采用Olsen法測定土壤有效磷[18]；采用標準酸滴定法測定土壤堿解氮[19]；采用火焰光度計測定速效鉀[20]。

2.2 球莖生長性狀的測定

用直尺測量西紅花球莖縱徑、橫徑，用電子天平測量西紅花球莖鮮質量。按照球莖鮮質量進行編號如下：浙江建德1（球莖鮮質量＜25 g）、浙江建德2（球莖鮮質量＞30 g）、上海崇明1（球莖鮮質量＜25 g）、上海崇明2（球莖鮮質量＞25 g）、陜西澄城1（球莖鮮質量＜10 g）、陜西澄城2（球莖鮮質量＞15 g），每組50個。

2.3 根際細菌的分離與純化

用無菌水將根際土配制成0.1～10?6濃度梯度的混懸液，涂布于培養基上分離根際細菌[21]，NA培養基用于分離普通細菌，改良高氏1號培養基用于分離放線菌。

2.4 細菌16S分子鑒定

將分離得到的單一菌株通過單菌落形態特征包括形態、顏色、干濕、凹凸等，進行分類。以天根試劑盒提取細菌DNA。采用16S rDNA通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）進行PCR擴增。PCR采用50 μL體系，包括25 μL 2×Taq Mix，21 μL ddH2O，2 μL模板DNA，上下游引物各1 μL[22]。擴增結果經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，由生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。測序結果于NCBI進行BLAST比對，采用MEGA 7軟件建立系統發育樹，確定分離菌株的分類地位。

2.5 根際細菌多樣性及組成分析

分離頻率以相對頻率（relative frequency，RF）表示，具體為分離到的某細菌的菌株數占分離到總菌株數的百分數。優勢菌群通過Camargo指數（1/S）確定，如果某一菌群的相對頻率＞1/S，則該菌群為優勢菌群[23]。采用Shannon-Wiener指數（′）分析根際細菌的生物多樣性[24]。采用Pielou均勻度指數（）分析不同物種分布的均勻程度[25]。采用Maragalef指數（）來評價物種豐富度[26]。

2.6 數據分析

采用SPSS軟件對西紅花生境因子、球莖生長性狀與根際細菌RF、多樣性進行皮爾遜相關性分析，結果以相關系數（）表示。

3 結果與分析

3.1 西紅花根際土壤理化因子

不同產地西紅花根際土壤理化因子存在差異（＜0.05）（表1）。供試西紅花根際土壤堿解氮變幅為77.011～245.431 mg/kg，其中浙江建德2堿解氮含量最大，達245.431 mg/kg，陜西澄城1球莖最小，質量分數僅為77.011 mg/kg。土壤速效鉀平均值為354.299 mg/kg，變幅為76.448～878.290 mg/kg，變幅較大，浙江建德1速效鉀含量（878.290 mg/kg）數值最大，上海崇明1速效鉀含量（76.448 mg/kg）數值最小，浙江建德1速效鉀含量約為上海崇明1含量的11.5倍。土壤pH變幅為5.20～8.33，變幅較小，其中陜西澄城1的pH數值最大，達8.33。

表1 不同產地西紅花根際土壤理化因子()

Table 1 Physical and chemical properties of C. sativus rhizospheric soil from different habitats ()

采集地點pH有機質/(g·kg?1)有效磷/(mg·kg?1)堿解氮/(mg·kg?1)速效鉀/(mg·kg?1) 浙江建德15.20±0.1319.134±1.09226.072±0.416200.949±5.910 878.290±15.559 浙江建德26.22±0.1521.489±0.62912.215±0.862 245.431±12.552611.921±8.063 上海崇明17.62±0.0622.172±0.08725.625±0.850 156.363±10.018 76.448±5.227 上海崇明28.05±0.1224.100±0.20933.087±1.018113.663±5.992 83.183±7.686 陜西澄城18.33±0.0611.371±0.07851.220±1.296 77.011±7.998 231.828±10.952 陜西澄城28.32±0.0311.251±0.08355.390±1.275127.017±8.351 244.125±10.596

3.2 西紅花球莖生長性狀

不同產地西紅花生長性狀存在差異（＜0.05）（表2）。供試西紅花球莖鮮質量變幅為8.50～32.05 g，平均鮮質量為21.17 g，其中浙江建德2球莖鮮質量數值最大，達32.05 g，陜西澄城1球莖最小，平均鮮質量僅為8.90 g。球莖橫徑平均值為3.88 cm，變幅為2.90～4.59 cm，變幅較大，上海崇明2球莖橫徑（4.59 cm）數值最大，陜西澄城1球莖橫徑（2.90 cm）數值最小，上海崇明2橫徑約為陜西澄城1橫徑的1.6倍。球莖縱徑變幅為1.90～3.07 cm，平均值為2.55 cm，其中浙江建德2的縱徑數值最大，達3.07 cm。

表2 西紅花球莖生長性狀()

Table 2 Growth characteristics of C. sativus corm ()

產地橫徑/cm縱徑/cm鮮質量/g 浙江建德13.62±0.31c2.55±0.21c17.39±3.42c 上海崇明14.03±0.16b2.52±0.15c21.82±2.04b 陜西澄城12.90±0.26d1.90±0.20e 8.50±1.93d 浙江建德24.50±0.28a3.07±0.36a32.05±5.75a 上海崇明24.59±0.19a2.93±0.19b31.07±1.44a 陜西澄城23.64±0.23c2.30±0.25d16.20±2.68c

不同字母表示差異顯著，＜0.05

Different letters denote significant differences,< 0.05

3.3 根際細菌的純化與鑒定

共分離得到西紅花根際細菌2450株，其中NA培養基共分離得到根際細菌1274株，改良高氏一號培養基共分離得到根際細菌1176株。將上述根際細菌劃分為275個形態型。鑒定為65個分類單元，歸屬于4個門，6個綱，8個目，17個科，28個屬，31種（圖1）。其中厚壁菌門（Firmicutes）占比最大，RF為66.76%，變形菌門（Proteobacteria）次之，RF達25.27%，65個細菌的16S序列均已提交到GenBank數據庫，序列號為MZ026391～MZ026455。

3.4 產地和土壤理化因子與細菌菌群結構和多樣性的相關性分析

產地與土壤理化因子影響西紅花根際細菌多樣性及菌群結構，多樣性指數最高的為陜西澄城（′＝2.561 7），上海崇明（′＝2.175 1）次之，最低的為浙江建德（′＝1.987 4），見表3。土壤理化因子與西紅花根際細菌多樣性顯著相關，其中多樣性指數與土壤有效磷含量呈最大正相關（＝0.910，＜0.05）（表4）；上海崇明和浙江建德的優勢門為厚壁菌門，而陜西澄城優勢門為厚壁菌門和變形菌門；上海崇明2的芽孢桿菌屬RF值約為陜西澄城2的2.1倍（表3）。土壤理化因子方面，有效磷含量與根際細菌菌群結構最密切，其與芽孢桿菌屬RF呈最大負相關（＝?0.914，＜0.05），與微桿菌屬RF呈最大正相關（＝0.962，＜0.01）（表4）。

MK-Marker，條帶下方為菌株編號

表3 不同產地西紅花根際細菌高分離頻率屬及多樣性比較

Table 3 Comparison of high RF and diversity of C. sativus rhizospheric bacteria from different habits

產地分離頻率（RF＞5%）H′JR 浙江建德1芽孢桿菌屬（65.46%）、類芽孢桿菌屬（18.18%）、假單胞菌屬（7.27%）1.841 90.718 12.994 5 上海崇明1芽孢桿菌屬（66.67%）、賴氨酸芽孢桿菌屬（7.02%）、類芽孢桿菌屬（7.02%）2.114 30.705 84.699 4 陜西澄城1芽孢桿菌屬（45.63%）、蒼白桿菌屬（32.04%）、微桿菌屬（8.74%）2.361 60.788 34.099 5 浙江建德2芽孢桿菌屬（75.00%）、賴氨酸芽孢桿菌屬（10.71%）、類芽孢桿菌屬（5.36%）1.724 30.693 92.732 7 上海崇明2芽孢桿菌屬（73.33%）、農桿菌屬（8.89%）1.869 60.708 43.415 1 陜西澄城2芽孢桿菌屬（35.00%）、蒼白桿菌屬（28.33%）、微桿菌屬（10.00%）、無色桿菌屬（8.33%）2.590 10.850 84.904 9

表4 西紅花根際細菌多樣性、菌群結構與土壤理化因子、球莖大小的相關性分析

Table 4 Correlation analysis of C. sativus rhizospheric bacterial diversity and community with physical and chemical properties and growth characteristics

指標相關系數 pH有機質有效磷堿解氮速效鉀鮮質量橫徑縱徑 芽孢桿菌屬?0.535 0.951**?0.914* 0.581 0.221 0.793* 0.752* 0.823* 蒼白桿菌屬 0.619?0.956** 0.900*?0.666 0.280?0.767*?0.773*?0.832* 類芽孢桿菌屬?0.880* 0.463?0.582 0.585 0.719 0.125 0.132 0.312 微桿菌屬 0.827*?0.794 0.962**?0.822* 0.549?0.578?0.546?0.692 賴氨酸芽孢桿菌屬?0.577 0.518?0.861* 0.854* 0.375 0.523 0.475 0.573 無色桿菌屬 0.249?0.744 0.625?0.124 0.052?0.380?0.335?0.359 農桿菌屬 0.423 0.593?0.087?0.302?0.627 0.611 0.653 0.477 Leclercia屬 0.606 0.213 0.190?0.691?0.756?0.030?0.018?0.190 寡養單胞菌屬 0.724?0.501 0.641?0.401?0.545?0.094?0.030?0.212 假單胞菌屬?0.604?0.201 0.058 0.279 0.711?0.321?0.283?0.122 H′ 0.712?0.843* 0.910*?0.682?0.478?0.724?0.658?0.806* J 0.561?0.917* 0.916*?0.564?0.234?0.677?0.634?0.713 R 0.737?0.503 0.689?0.617?0.690?0.513?0.404?0.627

*表示顯著相關，*＜0.05**＜0.01

significant correlations are marked with*,*< 0.05**< 0.01

3.5 球莖大小與細菌菌群結構和多樣性的相關性分析

球莖大小與根際細菌菌群結構和多樣性顯著相關。球莖縱徑與多樣性指數′呈現顯著負相關（＝?0.806，＜0.05）。在相同產地中，浙江建德1的類芽孢桿菌屬占比約為浙江建德2的3.4倍（表3）。陜西澄城1的優勢屬為芽孢桿菌屬、蒼白桿菌屬、微桿菌屬，其中蒼白桿菌屬在西紅花根際細菌中的分布與鮮質量呈現顯著負相關（＝?0.767，＜0.05）。浙江建德2和上海崇明2的優勢屬為芽孢桿菌屬，共同優勢屬芽孢桿菌屬在浙江建德2的RF約為陜西澄城1的1.6倍，芽孢桿菌屬在西紅花根際細菌中的分布與西紅花球莖鮮質量呈顯著正相關（＝0.793，＜0.05）（表4）。

4 討論

西紅花根際可培養細菌資源豐富，共分離出2 450株細菌，歸屬于4個門，6個綱，8個目，17個科，28個屬，31種，其中厚壁菌門分離頻率最高，主要以芽孢桿菌屬為主，這與姜午春[27]分離根際細菌的結果一致。變形菌門細菌中分離頻率最高的屬為寡養單胞菌屬，該屬細菌目前已被報道具有抗病、促生等功能[28]。此外，本研究所得28個屬，其中屬為一年內剛建立的屬[29]，僅作為植物內生細菌被分離[30]。其余屬皆已有在土壤中分離的報道，其中芽孢桿菌屬、假單胞菌屬為常見根際細菌[31-32]，有固氮、溶磷、促生等作用[33-35]。本研究鑒定到種水平的細菌共31種，其中4種為首次從土壤中分離得到，分別是、、、，其中僅作為一種葉際放線菌從土豆的葉際被分離得到[36]。此外，本研究首次從土壤中分離得到細菌，該菌被報道對西紅柿具有較好的促生作用[37]。

產地對西紅花根際細菌菌群結構和多樣性存在影響，多樣性指數：陜西澄城＞上海崇明＞浙江建德，陜西澄城多樣性指數最高，且蒼白桿菌屬和微桿菌屬RF高于其他產地，為陜西澄城獨有優勢屬。鄒立思等[38]采用磷脂脂肪酸技術分析了不同產地太子參根際微生物，報道不同產地的太子參根際微生物含量及群落結構存在較大差異。土壤理化因子與西紅花根際細菌菌群結構和多樣性顯著相關，在本研究中，分析結果顯示芽孢桿菌屬與有效磷含量存在負相關，可能是芽孢桿菌屬細菌具有促進西紅花根系吸收磷元素的功能，劉鵬[38]研究發現，解淀粉芽孢桿菌一定程度上增加植物對磷的吸收，增加植株生物量。此外，本研究數據顯示速效鉀與根際微生物結構沒有明顯相關性，這與王文銅[39]對花生根際細菌16S rDNA文庫進行典范對應分析（canonical correspondence analysis，CCA）和冗余分析（redundancy analysis，RDA）的結果一致。

植物與根際微生物存在著互利共惠的關系，一方面，植物通過招募有益的微生物，促進自身生長發育、提高對病原菌與非生物脅迫的抗性，另一方面，植物為微生物提供根際共生的棲息場所，并通過釋放不同的根系分泌物為微生物提供營養，影響著根際微生物菌群結構與分布[41-42]。本研究表明西紅花球莖大小與根際細菌菌群結構密切相關，芽孢桿菌屬在西紅花根際細菌中的分布與球莖鮮質量呈現正相關，表明高豐度的芽孢桿菌屬細菌可能對西紅花球莖生長有益。眾多研究也表明芽孢桿菌屬細菌具有促生功能，如枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和多粘類芽孢桿菌皆被報道有促生作用，其主要促生機理通過產生植物激素促進植物生長[33, 43-45]。陸續對得到的根際細菌進行了功能篩選，并獲得了一批功能菌株，如篩選得到的3株根際細菌SR163、SR253、SR375對擬南芥有較好的促生作用，其他功能篩選正在進行中。本研究為根際細菌菌群優化、土壤修復及藥用植物共生微生物資源開發提供了參考依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Community, diversity and distribution of culturable bacteria in rhizosphere of

ZHANG Jia-hao, LU Jie-miao, DING Yu-ting, QIN Lu-ping, ZHU Bo

School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 311402, China

To explore the rhizospheric bacterial community of Xihonghua () and analyze their correlation with physical and chemical properties ofrhizospheric soil and growth characteristics of.Rhizospheric bacteria were isolated fromrhizospheric soil collected from Zhejiang Jiande, Shanghai Chongming, and Shaanxi Chengcheng by the traditional coating method. Diversity and bacterial community were analyzed and their correlation with habitat factors and growth characteristics were studied.A total of 2 450 strains of rhizospheric bacteria were isolated and divided into 65 taxa belonging to 4 phyla, 6 classes, 17 families, 28 genera, and 31 species. The most dominant phylum was Firmicutes (RF＝66.76%) while the most dominant genus was(RF＝57.71%). Habitat and physical and chemical properties significantly correlation with the diversity and community of the rhizospheric bacteria in. The diversity index of Shaanxi Chengcheng 2 ('＝2.590 1) was the highest. The correlation coefficient of the diversity index with available phosphorus content shows a significant positive correlation (＝0.910,＜0.05). Organic matter is closely related to community structure, whose correlation coefficient withRF ofis the largest (＝?0.956,＜0.01). The longitudinal diameter ofcorm significantly correlation with the diversity index (＝?0.806,＜0.05). Corm fresh weight significantly correlation with the rhizospheric bacterial community. The corm fresh weight had the largest positive correlation with the RF of(＝0.793,＜0.05).There are abundant resources of culturable bacteria in the rhizosphere of. Physical and chemical properties and corm fresh weight significantly correlation with the community and diversity of rhizospheric bacteria in, and the higher abundance ofmay play a beneficial role incorm growth.

L.; rhizospheric bacteria; bacterial community; diversity; soil physicochemical properties

R286.2

A

0253 - 2670(2022)08 - 2499 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.08.027

2021-10-09

浙江中醫藥大學人才專項（2021ZR09）；浙江省醫藥衛生科技青年創新人才支持計劃項目（2022RC052）；浙江省優勢特色學科（中藥學）開放基金資助項目（ZYAOX2018018）

張家豪（1996—），男，河北石家莊人，碩士研究生，研究方向為中藥資源及品質評價。

秦路平，教授，博士生導師，研究方向為中藥資源及品質評價。E-mail: lpqin@zcmu.edu.cn

朱 波，副研究員，碩士生導師，研究方向為植物內生菌。E-mail: zhubo@zcmu.edu.cn

[責任編輯 時圣明]