“保健功能-中藥-中藥”關聯的石斛保健食品配方規律分析及斑馬魚增強免疫力和緩解體力疲勞功能評價

任雪陽，王 宇，魏勝利，楊語哲，劉曉云，宋若蘭，魏 靜，單東杰，夏 青，折改梅

·數據挖掘與循證醫學·

“保健功能-中藥-中藥”關聯的石斛保健食品配方規律分析及斑馬魚增強免疫力和緩解體力疲勞功能評價

任雪陽1，王 宇1，魏勝利1，楊語哲1，劉曉云1，宋若蘭1，魏 靜1，單東杰1，夏 青2*，折改梅1*

1. 北京中醫藥大學中藥學院，北京 100029 2. 齊魯工業大學（山東省科學院），山東省科學院生物研究所，山東 濟南 250103

探究石斛相關保健食品的配方規律，并基于模式生物斑馬魚對含石斛的具有增強免疫力和緩解體力疲勞雙功能保健食品的配方進行活性評價。對現有含石斛的保健食品批文中的信息資料進行統計分析，利用社團分析方法，探究石斛相關保健食品中保健功能與中藥之間的聯系規律；采用關聯和復雜網絡機器學習算法分析石斛相關保健食品配方中中藥與中藥之間的關聯規則，以期深度挖掘其中的“保健功能-中藥-中藥”關聯性。基于此，設計以石斛為核心原料的具有增強免疫力和緩解體力疲勞雙功能保健食品的候選配方；建立2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（AAPH）和甲硝唑誘導的氧化應激斑馬魚模型及機械損傷炎癥和神經炎癥斑馬魚模型，對其中1種候選配方進行抗炎和抗氧化活性評價。共收集到含石斛的保健食品批文133件，保健功能以增強免疫力和緩解體力疲勞為主。經篩選共得到含石斛且具增強免疫力和緩解體力疲勞雙功能的保健食品配方64個，所有保健功能和中藥共分為7個社團，歸納為7種治療原則，得出相應7種中醫證型。統計分析發現保健食品配方中高頻中藥之間具有較強的關聯性，并得到了核心中藥組合與核心配方，確定10種中藥配伍，設計了6個配方。斑馬魚活性實驗結果表明其中1種候選配方（石斛、枸杞子和黃芪）對斑馬魚氧化應激損傷和炎癥反應均有一定改善作用。機器學習算法指導中藥配方合理，為中藥類保健食品的配方研發和活性評價提供新的思路和方向。

保健食品；石斛；配方規律；機器學習算法；斑馬魚；增強免疫力；緩解體力疲勞；抗氧化；抗炎

石斛為蘭科植物金釵石斛Lindl.、霍山石斛C. Z. Tang et S. J. Cheng、鼓槌石斛Lindl. 或流蘇石斛Hook. 的栽培品及其同屬植物近似種的新鮮或干燥莖[1]。石斛應用歷史悠久，具有益胃生津、滋陰清熱的功效，可改善現代人群普遍存在的“陰虛火旺”體質[2-3]。近年來，石斛在保健食品、中成藥的開發中成為熱點。目前已有文獻對鐵皮石斛在保健食品、中成藥等方面的開發現狀進行總結分析，但運用算法分析石斛用藥規律的研究罕見[3-6]。

數據挖掘算法如關聯、復雜網絡等可以分析數據之間的內在規律，挖掘類群信息、關聯規則等[7]。在中醫藥領域，數據挖掘算法可用于構建疾病-證候-治法-中藥-穴位等多靶點效應網絡，挖掘“疾病-治法、治法-中藥、證型-中藥”等之間的聯系[8]。本研究引入復雜網絡分析算法構建“保健功能-中藥-中藥”多層次網絡，分析保健食品中保健功能和中藥、中藥和中藥之間的關系，一方面針對目前保健食品缺乏中醫證型界定的現狀，歸納出不同保健功能下對應的治療原則，做出中醫證型的推薦，為石斛保健食品的辨證應用提供參考；另一方面深度挖掘配方中的配伍規律，揭示不同保健功能對應的核心中藥組方，以指導石斛保健食品的開發。

現代醫學認為免疫力是機體識別和消滅外來侵入異物，處理機體衰老、損傷等細胞的能力，免疫力與自由基，如活性氧（reactive oxygen species，ROS）等密切相關[9]。ROS的積聚會導致氧化應激，損害線粒體和細胞，使人體免疫機能下降[10]。同時，還會引起肝臟和骨骼肌線粒體的脂質過氧化損傷，從而引發疲勞[11]。炎癥是機體應對各種損傷性刺激時進行自我保護的防御反應，過度的炎癥反應會刺激生成過多ROS，造成氧化應激損傷[12-13]。因此，抑制氧化應激反應和炎癥反應是提高機體免疫力、緩解體力疲勞的基礎。斑馬魚（，zebrafish）具有體積小、繁殖能力強、發育快、易于觀察、免疫系統高度保守等優勢，被廣泛用于研究人類免疫、炎癥相關疾病[14-15]。

基于此，本研究通過檢索國家市場監督管理總局（State Administration for Market Regulation，SAMR）特殊食品安全監督管理司網站，對含石斛的保健食品批文進行整理和統計，分析現有含石斛的保健食品配方、保健功能等，并通過關聯和復雜網絡等機器學習算法深度挖掘配方規律。同時，引入模式生物斑馬魚氧化應激模型和炎癥模型，用于石斛保健食品增強免疫力和緩解體力疲勞雙功能的快速評價，為保健食品配方篩選和功能評價模型提供新的選擇。

1 材料

1.1 儀器

斑馬魚養殖系統，北京愛生科技有限公司；SZX-16型體視熒光顯微鏡，日本Olympus公司；AXIO Zoom. V16型體視熒光顯微鏡，卡爾蔡司（上海）管理有限公司；Spectra MR酶標儀，美國Dynex公司；SPX-280B-G型博訊光照培養箱，上海基星生物科技有限公司；HPG-280BX型光照培養箱，哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司。

1.2 試劑與試藥

鐵皮石斛（批號Y20180601），文山華信三七股份有限公司；枸杞子（批號20181010），亳州八方飲品有限公司；黃芪（批號60541002），北京同仁堂北苑雙營藥店有限責任公司；以上藥材經北京中醫藥大學中藥學院魏勝利教授分別鑒定為蘭科植物鐵皮石斛Kimura et Migo的干燥莖、茄科植物寧夏枸杞L. 的干燥成熟果實和豆科植物蒙古黃芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪(Fisch.) Bge. 的干燥根。候選配方4，實驗室自制（制備方法：取鐵皮石斛0.75 g、黃芪3 g、枸杞子6 g，打粉過篩，加適量輔料制粒而得），用新鮮斑馬魚培養水配制成2 mg/mL的母液，放入?20 ℃冰箱備用，用時以斑馬魚培養水稀釋成所需濃度；甲硝唑（批號J10GS53398），阿拉丁試劑（上海）有限公司，用新鮮斑馬魚培養水配制成10 mmol/L的甲硝唑母液；2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（AAPH），Sigma-Aldrich貿易有限公司，用新鮮斑馬魚培養水配制成25 mmol/L的AAPH母液；乙酰半胱氨酸，碧云天生物技術有限公司，用新鮮斑馬魚培養水配制成200 mmol/L的乙酰半胱氨酸母液；ROS染色試劑盒，碧云天生物技術有限公司；三卡因，Sigma-Aldrich貿易有限公司；五水硫酸銅（分析純），國藥集團化學試劑有限公司，用新鮮斑馬魚培養水配制成40 μmol/L的硫酸銅溶液；布洛芬（批號H01S9Z69098），阿拉丁試劑（上海）有限公司，用新鮮斑馬魚培養水配制成20 mmol/L的布洛芬溶液。

1.3 動物

本實驗選用AB系斑馬魚，Tg（krt4：NTR-hKikGR）cy17（以下簡稱cy17）系和綠色熒光標記中性粒細胞Tg（lyz：EGFP）cz58（以下簡稱cz58）系的轉基因斑馬魚，由山東省科學院生物研究所提供。斑馬魚成魚在黑暗10 h/光照14 h，（28.0±0.5）℃條件下飼養，每天定時定量喂食。按照實驗需要選取同品系斑馬魚按照雌雄比例1∶1放置于產卵缸中配對產卵，收取受精卵，消毒后置于黑暗10 h/光照14 h、（28.0±0.5）℃光照培養箱中，孵育備用。

2 方法

2.1 石斛保健食品配方規律分析

2.1.1 數據來源及納入標準 保健食品信息以“石斛”為關鍵詞，在SAMR特殊食品安全監督管理司官網（http://www.samr.gov.cn/tssps/）上進行檢索，收集截至2021年9月30日所收錄的所有保健食品批文信息，主要涉及鐵皮石斛、金釵石斛、霍山石斛等石斛屬植物。在收集整理過程中，排除沒有配方、保健功能信息的批文，共獲得到含石斛的保健食品批文133件。

2.1.2 數據庫的建立與標準化 將收集到的數據信息導入Microsoft Excel 2019，參照《中國藥典》2020年版[1]和《臨床中藥學》第2版[16]對保健食品批文的中藥信息進行標準化處理：（1）將習用名改為藥典或地方標準中記載規范名稱，如“金叉石斛”“細莖石斛”等統一為“石斛”；（2）將同一味藥的不同炮制規格改為原藥名，如“馬鹿茸粉”統一為“馬鹿茸”等；（3）將藥材提取物改為原藥材名，如“西洋參提取物”統一為“西洋參”；（4）將相同配方相同功效的批文合并處理；（5）若有改變名稱后功效影響顯著者，則保留原有記錄，分別錄入處理，如“生地黃”和“熟地黃”等。

2.1.3 分析方法 利用Microsoft Excel 2019對數據庫中含石斛的保健食品配方的保健功能、中藥及其類型進行頻數統計。將數據庫中配方錄入中國中醫科學院中醫藥信息研究所古今醫案云平臺V2.2.3提供的模板中，使用數據標準化模塊對數據再次進行核對，獲得標準化數據庫，納入分析池，使用數據挖掘模塊對配方中的中藥進行性味歸經統計，并進行社團分析，挖掘“保健功能-中藥”之間的聯系。

應用SPSS Modeler 18.0中的Apriori關聯規則算法和網絡圖分析含石斛且具有增強免疫力和緩解體力疲勞功能的保健食品配方中“中藥-中藥”的聯系；采用古今醫案云平臺V2.2.3數據挖掘模塊中的基于多尺度backbone算法的復雜網絡分析分別得到石斛增強免疫力、緩解體力疲勞保健食品的核心配方，最后根據以上研究結果設計配方。本研究的技術路線如圖1所示。

2.2 候選配方抑制氧化應激和抗炎活性快速評價方法的建立

2.2.1 最小致死濃度的篩選 挑選發育1 dpf（days post fertilization，受精后天數）的AB系斑馬魚幼魚，置于12孔板中，每孔10條。根據預試驗結果，設置8個給藥濃度，終質量濃度分別為700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400 mg/L，同時設對照組和模型組，對照組加入2 mL新鮮斑馬魚培養水，模型組加入1 mL甲硝唑母液，其他各組加入對應體積的候選配方母液和1 mL 甲硝唑母液，并用新鮮斑馬魚培養水補至2 mL，所有斑馬魚置于（28.0±0.5）℃光照培養箱中培養48 h，每隔12 h統計，記錄斑馬魚死亡情況，計算死亡率，繪制量-毒曲線，計算最小致死濃度（minimum lethal concentration，MLC）和半數致死濃度（median lethal concentration，LC50）。

2.2.2 抑制AAPH誘導的斑馬魚氧化應激活性評價 挑選發育1 dpf的AB系斑馬魚幼魚，置于12孔板中，每孔10條。設置對照組、模型組、陽性對照組和候選配方組。根據MLC的篩選結果，候選配方組設置為3個給藥亞組（50、100和200 mg/L）。對照組加入2 mL新鮮斑馬魚培養水，陽性對照組加入2 μL乙酰半胱氨酸母液，候選配方組加入對應體積的候選配方母液。除對照組外，其他各組均加入1 mL AAPH母液，并用新鮮斑馬魚培養水補至2 mL。給藥時間為24 h，實驗重復3次。24 h后，參照ROS試劑盒說明書對斑馬魚體內ROS進行染色，0.25 mg/mL三卡因麻醉，于熒光顯微鏡下采集圖片，并利用Image-pro Plus 5.1軟件統計各組斑馬魚的ROS熒光強度。

2.2.3 抑制甲硝唑誘導的斑馬魚氧化應激活性評價 挑選發育1 dpf的cy17系斑馬魚幼魚，置于12孔板中，每孔10條。分組同“2.2.2”項，對照組加入2 mL新鮮斑馬魚培養水，陽性對照組加入2 μL乙酰半胱氨酸母液，候選配方組加入對應體積的候選配方母液（終質量濃度分別為50、100和200 mg/L）。除對照組外，其他各組均加入1 mL甲硝唑母液，并用新鮮斑馬魚培養水補至2 mL。給藥時間為24 h，實驗重復3次。24 h后，0.25 mg/mL三卡因麻醉，于熒光顯微鏡下采集圖片，觀察斑馬魚的皮膚熒光點數，并利用Image-pro Plus 5.1軟件統計各組斑馬魚的皮膚熒光點數。

2.2.4 斑馬魚抗機械損傷炎癥活性評價 挑選發育3 dpf帶有熒光的cz58系斑馬魚幼魚，置于12孔板中，每孔10條。對照組先用0.25 mg/mL三卡因麻醉，再復蘇，加入2 mL新鮮斑馬魚培養水。其他各組均先用0.25 mg/mL三卡因麻醉，進行斑馬魚尾部橫切術，再復蘇；復蘇后，模型組加入2 mL新鮮斑馬魚培養水；陽性對照組加入2 mL布洛芬溶液；候選配方組加入對應體積的候選配方母液（終質量濃度分別為50、100和200 mg/L），再用新鮮斑馬魚培養水補至2 mL。給藥時間為6 h，實驗重復3次。6 h后，0.25 mg/mL三卡因麻醉，于熒光顯微鏡下采集圖片，觀察中性粒細胞和巨噬細胞炎癥反應，并利用Image-pro Plus 5.1軟件統計中性粒細胞和巨噬細胞遷移到斑馬魚機械損傷處（尾部橫切處）的熒光強度。

2.2.5 斑馬魚抗神經炎癥活性評價 挑選發育3 dpf帶有熒光的cz58系斑馬魚幼魚，置于12孔板中，每孔10條。對照組和模型組分別加入2 mL新鮮斑馬魚培養水，陽性對照組加入2 mL布洛芬溶液；候選配方組加入對應體積的候選配方母液（終質量濃度分別為50、100和200 mg/L），再用新鮮斑馬魚培養水補至2 mL。給藥時間為2 h。用新鮮斑馬魚培養水輕柔清洗斑馬魚胚胎3～5遍，對照組加入2 mL新鮮培養水，其他各組加入2 mL硫酸銅溶液。給藥時間為1 h，實驗重復3次。1 h后，0.25 mg/mL三卡因麻醉，于熒光顯微鏡下采集圖片，觀察中性粒細胞和巨噬細胞炎癥反應，并利用Image-pro Plus 5.1軟件統計各組斑馬魚中遷移至側線神經丘的中性粒細胞和巨噬細胞數量。

2.3 數據統計與分析

3 結果

3.1 含石斛保健食品配方規律分析

3.1.1 含石斛保健食品的保健功能、中藥及其性味歸經頻數分析 在133件含石斛的保健食品批文信息中，共涉及保健功能12種（表1）。其中增強免疫力功能的最多，占比65.88%；緩解體力疲勞功能居其次，占比18.24%，可見含石斛的保健食品以增強免疫力和緩解體力疲勞為主要保健功能。從傳統功效來看，可能與石斛“厚腸胃”“平胃氣”“清胃熱”“健脾開胃”等功效密切相關[17]。

經數據標準化后，從133件含石斛的保健食品批文中共篩出保健食品配方64個。除石斛外，共涉及64種原料藥味，累計頻次為181次。出現頻次≥3次的共有20種中藥，排名前5位的中藥分別為西洋參、枸杞子、麥冬、人參和靈芝，具體情況見表2。

對配方中除石斛外的64種中藥進行藥性統計分析。藥性統計按出現頻次高低依次為平性（31.21%）、涼性（24.86%）、微寒（15.03%）、溫性（13.29%）、微溫（9.25%）及寒性（6.36%），可見與石斛配伍的中藥多為平性、涼性藥；藥味按出現頻次高低依次為甘（51.06%）、微苦（17.96%）、苦（11.62%）、辛（7.39%）、酸（4.23%）、淡（2.46%）、咸（2.11%）、澀（1.41%）及微甘（1.06%），甘味藥居多，符合甘能補的藥味特性[18]；歸經按出現頻次高低依次為肺（25.32%）、腎（20.68%）、心（18.14%）、肝（12.45%）、脾（12.24%）、胃（8.65%）、大腸（1.27%）、膽（0.63%）、膀胱（0.21%）、心包（0.21%）及小腸（0.21%），可見與石斛配伍的中藥跟五臟均相關，以歸肺經、腎經和心經的藥味最多。

表1 含石斛的保健食品的保健功能頻數統計

Table 1 Frequency statistics of health-care functions of health products containing DendrobiiCaulis

保健功能頻數/次占比/%保健功能頻數/次占比/% 增強免疫力11265.88延緩衰老31.76 緩解體力疲勞 3118.24對輻射危害有輔助保護功能21.18 清咽潤喉 7 4.12改善睡眠10.59 對化學性肝損傷有輔助保護功能 4 2.35緩解視力疲勞10.59 提高缺氧耐受力 4 2.35抗突變10.59 調節血糖 3 1.76抗氧化10.59

表2 含石斛的保健食品配方中中藥頻數統計(頻數≥3)

Table 2 Frequency statistics of traditional Chinese medicines in health products containing DendrobiiCaulis (frequency ≥ 3)

中藥頻數/次占比/%中藥頻數/次占比/% 西洋參3046.88三七34.69 枸杞子1421.88玉竹34.69 麥冬 812.50丹參34.69 人參 710.94靈芝孢子粉34.69 靈芝 710.94葛根34.69 山藥 6 9.38玄參34.69 黃芪 6 9.38淫羊藿34.69 茯苓 5 7.81馬鹿茸34.69 黃精 5 7.81絞股藍34.69 當歸 4 6.25五味子34.69

3.1.2 含石斛保健食品的“保健功能-中藥”社團分析 將篩選出的64個保健食品配方錄入古今醫案云平臺V2.2.3提供的模板，各配方中中藥列入“中藥組成”項，其對應的保健功能列入“綜合療效”項。利用數據挖掘模塊中的社團分析功能，選擇前項為“療效”，后項為“中藥”，進行社團分析。社團結構是節點間因不同的連接程度所形成的結構。圖2中每個節點代表1種保健功能或中藥，“中藥”節點圍繞“保健功能”節點形成1個小社團，代表該保健功能下的常用中藥。

圖2中所有保健功能和中藥組成1個大網絡，整個大網絡由7個小社團構成，各個小社團以顏色區分。其中，西洋參、枸杞子、麥冬和人參等17味中藥與3個及3個以上社團、3個及3個以上保健功能均有連線，是小社團重疊較高的部分，這與頻次統計得到的高頻中藥基本相同。頻次統計偏重以數字的形式表明用藥頻次的高低；社團分析偏重以圖形形式展示保健功能與中藥之間的疏密聯系，2種方式可互為補充。每個社團的保健功能和主要中藥見表3。

由圖2和表3可知，改善睡眠、對化學性肝損傷有輔助保護功能同歸為1號社團，主要中藥丹參、五味子等多歸心經和肝經。化學性肝損傷的病因是感受毒邪，病位主要在肝。中醫認為不寐屬心神病變，主要由情志內傷等引起。肝主情志，可見失眠與肝有著密切的相關性，二者歸同一社團，治則為養心補肝，適用于肝血虧虛證。這與臨床上失眠“從肝論治”的理論相一致[19]。2號社團包含增強免疫力、對輻射危害有輔助保護功能和抗突變，3者均與免疫系統相關，用藥多有重疊，以益氣養陰為主，并兼有補血養血，對應氣血兩虛證[20]。提高缺氧耐受力和清咽潤喉同歸為4號社團，甘味藥、苦味藥居多，歸經多為肺經，以清熱潤肺滋陰為主，適合陰虛肺燥證。3號、5號、6號和7號社團分別對應緩解體力疲勞、調節血糖、延緩衰老和緩解視力疲勞，治則分別為滋補肝腎、滋陰健脾、養陰清熱、清肝明目，分別對應肝腎虧虛證、陰虛胃熱證、氣陰兩虛證和肝火上擾證的人群。

3.1.3 含石斛的增強免疫力、緩解體力疲勞保健食品配方規律分析 分別對含石斛且具有增強免疫力、緩解體力疲勞功能的保健食品配方中單味中藥進行頻數分析，除石斛外頻次排序前8的中藥分布見表4。可見增強免疫力、緩解體力疲勞2種保健功能中，西洋參和枸杞子均為其高頻藥味。

進一步分別對增強免疫力、緩解體力疲勞保健食品中與石斛配伍的中藥的性味歸經進行統計。與石斛配伍的中藥藥性以平性和涼性為主，藥味以甘、微苦為主，主要歸肺經、腎經和心經。說明增強免疫力和緩解體力疲勞2種保健功能配方中中藥屬性基本相似。

圖2 基于社團分析的含石斛保健食品保健功能和藥味的關聯分析

表3 不同保健功能及對應的主要中藥

Table 3 Different health-care functions and corresponding main traditional Chinese medicines

表4 含石斛的增強免疫力、緩解體力疲勞保健食品配方中中藥頻次統計(排序前8位)

Table 4 Frequency statistics of traditional Chinese medicines in health products containing DendrobiiCaulis with enhancing immunity and alleviating physical fatigue functions (top eight)

增強免疫力緩解體力疲勞 中藥頻數/次占比/%中藥頻數/次占比/% 西洋參2520.33西洋參1227.91 枸杞子10 8.13枸杞子 511.63 麥冬 7 5.69淫羊藿 3 6.98 人參 6 4.88黃精 2 4.65 黃芪 5 4.07靈芝 2 4.65 靈芝 5 4.07馬鹿茸 2 4.65 茯苓 4 3.25人參 2 4.65 山藥 4 3.25山藥 2 4.65

進一步分別對具有增強免疫力和緩解體力疲勞功能的保健品中排序前20位的中藥進行Apriori算法分析和網絡分析，以支持度＞10%、置信度＞50%作為篩選條件，得到常見中藥組合和網絡圖，結果如表5和圖3所示。支持度表示在所有數據中關聯中藥出現的比例；置信度表示關聯中藥之間聯系的強度；提升度主要是用來衡量關聯規則的前項與后項間的獨立性，提升度的大小與相關性的強弱呈正相關[21-23]。由表5可知，在增強免疫力的中藥組合中，關聯性較強的分別是靈芝和西洋參、枸杞子和西洋參的配伍；在緩解體力疲勞的原料中藥組合中，關聯性較強的是淫羊藿和西洋參、靈芝和西洋參、黃精和西洋參、枸杞子和西洋參的配伍。

表5 基于Apriori算法的含石斛的具有增強免疫力、緩解體力疲勞保健食品配方中常見中藥的二次關聯分析

Table 5 Quadratic association analysis of common traditional Chinese medicines in health products containing DendrobiiCaulis with enhancing immunity and alleviating physical fatigue functions based on Apriori algorithm

保健功能原料中藥組合實例支持度/%置信度/%提升度 增強免疫力靈芝→西洋參 510.64 60.001.13 枸杞子→西洋參1010.64 60.001.13 緩解體力疲勞淫羊藿→西洋參 318.75100.001.33 靈芝→西洋參 212.50100.001.33 黃精→西洋參 212.50100.001.33 枸杞子→西洋參 531.25 60.000.80

圖3 含石斛的具有增強免疫力(A) 和緩解體力疲勞(B) 功能保健食品配方中中藥網絡分析

為進一步揭示常見中藥之間的關系，進行網絡分析。從圖3可以看出，在增強免疫力保健功能的中藥組合中，枸杞子與西洋參相關性良好，同時靈芝與西洋參、茯苓與山藥的相關性連接線也比較清晰，關聯性較強；在緩解體力疲勞保健功能的中藥組合中，西洋參與枸杞子、淫羊藿、靈芝、黃精的關聯性較強。

借助古今醫案云平臺V2.2.3數據挖掘模塊中的復雜網絡分析功能，基于多尺度backbone算法，對“中藥-中藥”的關聯規律進行進一步分析，以反映中藥的重要性及其相互關系。數據錄入方法同“3.1.2”項，選擇前項為“中藥”，后項為“中藥”，類型為“多尺度的backbone網絡算法”，設置參數布局為concentric、邊權重為1，提取中藥組合網絡，見圖4。含石斛的具有增強免疫力功能保健食品配方的復雜網絡圖中共有46味中藥，核心配方為石斛、西洋參、枸杞子、人參、山藥和麥冬。含石斛的具有緩解體力疲勞功能保健食品配方的復雜網絡圖中共有21味中藥，核心配方為石斛、西洋參和枸杞子。

圖4 基于多尺度backbone算法的含石斛的具有增強免疫力(A) 和緩解體力疲勞(B) 保健食品配方的復雜網絡分析

綜合以上分析結果，篩選出石斛、西洋參、人參、黃芪、枸杞子、淫羊藿、麥冬、山藥、靈芝和黃精共10味中藥進行配方。綜合社團分析所得的增強免疫力和緩解體力疲勞保健食品“益氣養陰”和“滋補肝腎”的治療原則，共形成6個配方。參考《中國藥典》2020年版一部中藥材和飲片的規定用量、現有保健食品批文、中成藥中相關藥味的用量，并結合傳統中醫古籍、藥理作用研究相關文獻等，設計藥味的用量，配方信息見表6。因后期擬選擇候選配方4進行增強免疫力和緩解體力疲勞雙功能保健食品的研究與開發，故本研究選取配方4進行斑馬魚抑制氧化應激和炎癥反應的活性評價。

3.2 保健食品候選配方4抑制氧化應激和炎癥反應活性評價

3.2.1 最小致死濃度的篩選 AB系斑馬魚是一種野生型斑馬魚，經過多代培育后，具有清晰的遺傳背景，可用于安全性和一般活性的評價[24]。本實驗分析了候選配方4對AB系斑馬魚的最小致死濃度，并結合斑馬魚的狀態，來確定給藥劑量。由候選配方4對斑馬魚致死率的量-毒曲線（圖5）可知，候選配方4的LC50值為966.166 mg/L。利用SPSS（Version 25.0）計算得到候選配方4的MLC值為778.152 mg/L。在劑量篩選中發現，候選配方4質量濃度400～800 mg/L下，斑馬魚胚胎出現了魚鰾變小、卵黃囊吸收遲滯、心包水腫形態異常等一系列畸形癥狀，故實驗中設定候選配方4低、中、高劑量分別為50、100、200 mg/L。

表6 含石斛的具有增強免疫力和緩解體力疲勞功能的保健食品候選配方

Table 6 Candidate formulas of health products containing DendrobiiCaulis with functions of enhancing immunity and alleviating physical fatigue

編號君藥臣藥佐/使藥 1石斛（0.75 g）西洋參（1.5 g）枸杞子（6 g） 2石斛（0.75 g）西洋參（1.5 g）黃精（3 g） 3石斛（0.75 g）西洋參（1.5 g）淫羊藿（2 g） 4石斛（0.75 g）黃芪（3 g）枸杞子（6 g） 5石斛（0.75 g）人參（1 g）麥冬（2 g） 6石斛（0.75 g）山藥（5 g）靈芝（2 g）

3.2.2 抑制斑馬魚氧化應激活性評價 如表7和圖6所示，在AAPH誘導的AB系斑馬魚氧化應激模型中，與對照組比較，模型組斑馬魚體內熒光強度顯著增強（＜0.05），表明造模成功。經過候選配方4處理后，斑馬魚熒光強度有所降低，表明候選配方4對斑馬魚的氧化應激損傷有改善作用。隨著候選配方4濃度的提高，斑馬魚體內熒光強度逐步減小。當濃度增加到200 mg/L時，熒光強度最小，并呈現出顯著性差異（＜0.05）。

圖5 候選配方4斑馬魚量-毒曲線

表7 候選配方4對斑馬魚氧化應激損傷的改善作用()

Table 7 Effect of candidate formula 4 on oxidative stress damage in zebrafish()

組別劑量/(mg·L?1)IOD熒光點數/個 對照－1 006 054.91±218 675.78375.10±23.66 模型－2 020 931.73±382 838.09+94.40±19.90+ 陽性對照－1 376 616.90±373 544.71+*327.10±29.71+* 候選配方4 501 751 877.59±242 467.23+114.20±19.58+ 1001 788 052.99±13 305.17+192.30±20.02+* 2001 620 115.77±143 329.08+*202.00±14.97+*

與對照組比較：+＜0.05；與模型組比較：*＜0.05，表8同

+< 0.05control group;*< 0.05model group, same as table 8

在甲硝唑誘導的cy17系轉基因斑馬魚氧化應激模型中，與對照組比較，模型組斑馬魚皮膚熒光點數顯著降低（＜0.05），陽性對照組熒光點數顯著增加（＜0.05）。經過候選配方4處理后，斑馬魚皮膚熒光點數隨著候選配方4濃度的升高，熒光點數逐步增加，中、高劑量組顯著高于模型組（＜0.05），表明候選配方4具有較好的抑制斑馬魚氧化應激損傷的作用。

3.2.3 抗機械損傷和抗神經炎癥活性評價 候選配方4抗機械損傷和抗神經炎癥的評價結果見表8和圖7。在尾部橫切術導致的機械損傷炎癥模型中，相較于對照組，模型組斑馬魚中性粒細胞和巨噬細胞遷移到機械損傷區域處的數量（以機械損傷區域的熒光強度計）顯著升高（＜0.05），說明斑馬魚斷尾炎癥模型構建成功，機械損傷造成了斑馬魚的炎癥反應。與模型組相比，經過候選配方4處理后，斑馬魚機械損傷區域處的中性粒細胞和巨噬細胞數量顯著減少，且呈劑量相關性。在硫酸銅導致的神經炎癥模型中，相較于對照組，模型組中性粒細胞和巨噬細胞遷移到斑馬魚側線的數量（熒光點數量）顯著增加（＜0.05），說明硫酸銅造成了斑馬魚的炎癥反應。與模型組相比，經過候選配方4處理后，斑馬魚中性粒細胞和巨噬細胞遷移到斑馬魚側線的數量顯著降低（＜0.05），且隨著給藥濃度的升高，熒光點數逐步減少。表明候選配方4對硫酸銅造成的斑馬魚的炎癥有顯著的改善作用，且與給藥濃度呈正相關。以上結果說明候選配方4具有顯著的抗炎作用。

A、B-候選配方4改善AAPH誘導的AB系斑馬魚氧化應激損傷情況 C、D-候選配方4改善甲硝唑誘導的cy17系斑馬魚氧化應激損傷情況與對照組比較：+P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05，圖7同

表8 候選配方4對斑馬魚炎癥反應的改善作用()

Table 8 Effect of the candidate formula 4 on inflammation in zebrafish()

分組劑量/(mg·L?1)IOD遷移數量/個 對照－207 928.01±8 755.531.50±0.71 模型－462 224.19±46 709.52+34.80±5.27+ 陽性對照－256 268.53±59 804.75*8.70±2.63+* 候選配方4 50346 856.04±27 694.39+*23.70±3.65+* 100279 195.53±51 439.47+*18.50±5.68+* 200257 988.27±47 204.36*13.50±3.34+*

A、B-候選配方4對機械損傷炎癥的改善情況 C、D-候選配方4對神經炎癥的改善情況

4 討論

本研究對國家市場監督管理總局于2021年9月30日前公布的含石斛的保健食品批文中的保健功能、中藥及性味歸經等進行統計分析。在此基礎上，引入社團分析方法，挖掘保健功能和中藥之間的關系。社團分析是復雜網絡算法的一種，社團結構是復雜系統模塊性和層次性的本質表現[8]。本研究采用社團分析“保健功能-中藥”的關系，將保健功能和中藥分為7個社團，歸納為7種治則，做出了中醫證型的推薦，為石斛保健食品的辨證應用提供參考。社團分析結果與中醫理論有一定相關性，表明不同保健功能可能對應相同的病機，治則具有一致性。社團分析中也存在因病機一致某些中藥屬于多個社團的情況，提示保健食品配方應考慮辨證應用，注意中藥的配伍使用。

含石斛的保健食品共涉及11種保健功能，以增強免疫力和緩解體力疲勞為主。Apriori算法是最經典的關聯規則算法，通過逐層搜索的方式迭代尋找數據庫中所有項集的關系，以形成規則[25]。Apriori算法在中醫藥領域應用廣泛，用以分析配伍規律，挖掘數據中的內部聯系[26]。復雜網絡是以網絡化建模形式研究復雜現象的一種分析方法，可以深入刻畫傳統中醫復雜體系內部的關系和特點[27]。本研究基于Apriori算法分析結果與復雜網絡分析所獲得的核心配方組成，綜合藥味頻數統計分析情況，篩選出核心藥味石斛、西洋參、人參、黃芪、枸杞子、淫羊藿、麥冬、山藥、靈芝和黃精10種中藥進行配伍，得到6個候選配方，并選取其中之一進行功能評價。

從傳統中醫理論來看，候選配方4中鐵皮石斛滋陰、清熱生津為君藥，扶正同時祛邪；黃芪補氣升陽、生津養血、利水；枸杞子補肝腎、益精，二者為臣藥，協同輔助鐵皮石斛扶持正氣。現代醫學研究也證實鐵皮石斛、枸杞子和黃芪均具有增強免疫力[28-30]、緩解體力疲勞[31-33]的作用。其中，鐵皮石斛含有多糖、黃酮和生物堿等多種化學成分[34]。以往認為，多糖是主要藥效成分，常用作品質評價的重要指標。隨著研究的深入，發現聯芐類、黃酮類成分具有抗炎、抗氧化、提高免疫等作用[35]。提高機體免疫力、緩解體力疲勞的關鍵在于抑制機體氧化應激反應和炎癥反應。近年來。斑馬魚作為模式生物在食品研發、藥物研發、毒性和有效性評價及疾病模型建立等方面應用廣泛[36]。本實驗采用AAPH誘導的AB系轉基因斑馬魚和甲硝唑誘導的cy17系轉基因斑馬魚氧化應激模型對候選配方4進行活性評價，發現其具有較好的抗氧化活性。在硫酸銅誘導的神經炎癥模型和尾部橫切術造模的機械損傷炎癥模型中，候選配方4可顯著緩解2種模型斑馬魚的炎癥反應，具有良好的抗炎活性。

綜上所述，本研究結合關聯分析和復雜網絡分析等算法探討石斛保健食品的配方規律，構建了“保健功能-中藥-中藥”網絡，得到石斛增強免疫力和緩解體力疲勞保健食品配方中的核心藥對和配方，為后期配方篩選提供了思路。本實驗建立的斑馬魚增強免疫力和抗疲勞功能評價模型造模周期短、檢測指標科學合理、客觀、靈敏易測。候選配方4具有良好的抑制氧化應激和抗炎作用，說明機器學習算法指導配方的合理性，為保健食品活性評價提供新的思路和方向。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Analysis on formula regularity of health products containingbased on “health functions-traditional Chinese medicines-traditional Chinese medicines” and evaluation of enhancing immunity and alleviating physical fatigue functions based on zebrafish

REN Xue-yang1, WANG Yu1, WEI Sheng-li1, YANG Yu-zhe1, LIU Xiao-yun1, SONG Ruo-lan1, WEI Jing1, SHAN Dong-jie1, XIA Qing2, SHE Gai-mei1

1. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 2. Biology Institute, Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences), Jinan 250103, China

To explore the formulation regularity of health products containing Shihu ()and to evaluate enhancing immunity and alleviating physical fatigue functions of health products containingbased on zebrafish model.The information of the approval documents on health products containingwere statistically analyzed. Community analysis method was used to analyze the relation and regulation between health functions and traditional Chinese medicines. association analysis and complex network analysis based on Apiror and multi-scale backbone algorithms were used to analyze the association rules between traditional Chinese medicines in health products formula containing Dendrobii Caulis, in order to deeply explore the relations of “health functions-traditional Chinese medicines-traditional Chinese medicines” of all the traditional Chinese medicines in health products formula with enhancing immunity and alleviating physical fatigue functions. By combining all the analysis results, candidate formulas with enhancing immunity and alleviating physical fatigue functions were designed withas the main ingredient. Based on 2,2′-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride (AAPH)-induced and metronidazole-induced oxidative stress models and inflammation model of zebrafish, anti-inflammatory and anti-oxidant activities of one of the candidate formulas were evaluated.A total of 133 health products containingwere collected in which health function consist largely of enhancing immunity and alleviating physical fatigue. And 64 health products formulations containingwere obtained. All the health functions and traditional Chinese medicines were divided into seven communities, and they were summarized seven therapeutical principles and were classified seven syndrome patterns. It was found that the high-frequency traditional Chinese medicines have a stronger correlation with each other, and the core formulas were obtained based on correlation analysis and complex network analysis. The compatibility of 10 kinds of traditional Chinese medicines was determined and six formulations were designed. The results of zebrafish activity experiment showed that one of the candidate formulas (,and) had certain ameliorating effects on oxidative stress injury and inflammatory response of zebrafish.This study suggests that machine learning algorithm is reasonable to guide the formula of traditional Chinese medicines and it is expected to provide new ideas and methods for the development and activity evaluation of Chinese medicinal health products.

health products;; formulation regularity; machine learning algorithms; zebrafish; enhancing immunity; alleviating physical fatigue; anti-oxidant; anti-inflammatory

R283.21；R285

A

0253 - 2670(2022)08 - 2435 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.08.021

2021-11-21

北京市科技計劃課題（Z201100005420005）；桂林市技術創新引導計劃（2020010902）

任雪陽（1996—），女，碩士，研究方向為中藥化學。E-mail: renxueyang1996@163.com

折改梅（1976—），博士生導師，研究員，從事中（民族）藥藥效成分和新藥創制研究。E-mail: shegaimei@126.com

夏 青（1988—），副研究員，從事中藥品質評價與分子機制研究。E-mail: sdxq1021@163.com

[責任編輯 潘明佳]