基于靶標循環放大策略的雙色熒光傳感體系探索何首烏“九蒸九曬”炮制過程中不同蒸制次數對腎細胞的減毒作用

高 涵，劉史佳，龐會明，田蔣為*，戚 進*

基于靶標循環放大策略的雙色熒光傳感體系探索何首烏“九蒸九曬”炮制過程中不同蒸制次數對腎細胞的減毒作用

高 涵1，劉史佳2，龐會明2，田蔣為1*，戚 進1*

1. 中國藥科大學中藥學院，江蘇 南京 211198 2. 江蘇省中醫院 藥學部，江蘇 南京 210029

通過采用所建立的雙色熒光傳感體系nanoflare測定腎細胞分泌的和表達，觀察經“九蒸九曬”炮制后的制首烏對腎細胞的毒性作用。生首烏和不同炮制次數制首烏的水提物與腎細胞孵育后，利用雙色熒光傳感體系nanoflare對給藥前后細胞培養基中的和進行定量檢測。通過比較不同炮制次數的何首烏水提物的毒性，發現伴隨著炮制次數的增加，雙色熒光傳感體系的熒光恢復強度在不斷減弱，制首烏水提物處理后的細胞培養基中和的表達在不斷減少，說明在炮制過程中毒性逐漸減弱，炮制至第9次時毒性明顯減弱，對腎細胞未產生明顯毒性，表明制首烏水提物對腎細胞的毒性隨炮制次數增加在不斷降低。生首烏毒性很強，而經炮制后的制首烏毒性逐漸減弱，在炮制次數超過9次后基本無毒，表明通過“九蒸九曬”在細胞水平可以達到減毒的作用，為制首烏炮制工藝與質量標準的完善提供參考。

藥物性腎損傷；微小RNA；靶標循環放大策略；何首烏；炮制減毒；九蒸九曬

何首烏是蓼科植物何首烏Thunb的干燥塊根，由于其生品有小毒，臨床上多以其炮制品——制首烏入藥。制首烏性溫，味甘澀，歸肝、腎經，具有補腎烏須、補益精血等功效[1]，為著名的滋補類中藥。近年來，國內外不斷出現含制首烏的相關復方、制劑導致肝、腎毒性的報道[2-5]，引起了相關部門和科研工作者的高度關注。有學者認為其原因可能與其近現代炮制方法的改變有關。有研究者對其“九蒸九曬”炮制工藝進行了大量研究，也證實了“九蒸九曬”對何首烏的肝毒性有明顯的減毒作用[6-12]。然而，此前的研究主要集中于“九蒸九曬”炮制工藝過程中化學成分的變化和不同蒸制次數對肝毒性的影響，卻很少有研究探索“九蒸九曬”法對何首烏致腎毒性的影響。其中的主要原因之一可能與腎毒性產生的生物標志物豐度較低，因此難于檢測有關。

隨著科學技術的快速發展，分析生物標志物已經成為了解和分類疾病發病機制的一類多學科方法。由于蛋白質的多樣性，且對蛋白質的測定具有易出現假陽性、費時、需要專門儀器等諸多缺點，因此基于蛋白質類生物標志物的評估往往具有一定的挑戰性。相反，參考理想標志物的規定，細胞外miRNA符合標準[13]：miRNA在不同的體液中可以被輕易獲取；miRNA可以保持很高的穩定性；miRNA序列在物種間具有高度的保守性；miRNA與特定組織或病理狀態相關。

迄今為止，在腎臟的毒性生物學標志物探索方面，針對miRNA的工作非常注重于對尿液的研究，因為它直接衍生自腎臟，并且尿液研究是一種非侵入性的研究方法。此外，由于胞外miRNA在物種間的高度保守性和在體液中容易取樣的便捷性[14]，細胞外的miRNA作為生物學標志物在藥物研發中具有更多的優勢：科學家們研究在細胞培養液中存在著的miRNA主要表現在探索其在細胞間通訊聯系中的潛在作用，miRNA可以從受損傷的腎臟細胞中被釋放出來，因此，經藥物誘導損傷的細胞和未經藥物處理的正常細胞的培養基具有不同的miRNA譜[15]。研究發現，的表達與腎小球和腎小管間質的腎臟發病密切相關，而腎小管細胞壞死是藥物性腎損傷的主要發病機制之一，在整個過程中發揮著重要的轉錄后調控作用[16-17]，同時，在患有急性腎損傷的病患的尿液中和的表達顯著增加；使用造影劑泛亞氨酸處理原代近端腎小管上皮細胞后，細胞培養基中、和的表達顯著增加[18]，可以看出，和與藥物性腎損傷有著密切的聯系，其參與腎組織損傷的調節，是近年來被發現的藥物性腎損傷相關的新型生物標志物[19]。

本課題組前期已建立一種靶標循環放大策略的雙色熒光傳感體系nanoflare用于對和的熒光檢測[20]。如圖1所示，納米金顆粒（Au nanoparticles，AuNPs）被分別用FAM和Cy5標記的DNA發卡檢測鏈1和2功能化，DNA發卡檢測鏈1和2分別設計用于響應和。在沒有靶標miRNAs存在的情況下，由于分子內雜交的阻滯，在AuNPs上修飾的DNA發卡檢測鏈（1和2）和DNA發卡燃料鏈（1和2）保持完整，并且染料FAM和Cy5的熒光被AuNPs淬滅，此時，幾乎沒有熒光背景。相反，當用腎毒性藥物刺激人腎近端小管上皮細胞（renal proximal tubule epithelial cells，RPTEC）時，miRNAs分泌到細胞外的環境中，一旦雙色熒光傳感體系nanoflare遇到互補的miRNAs靶標，即細胞經刺激分泌出的和，則雜交雙鏈1-miR-21和2-miR-200c將會形成，從而產生用于miRNAs檢測的FAM和Cy5的雙色熒光。在DNA發卡檢測鏈和靶標miRNAs雜交后，DNA發卡燃料鏈將與單鏈DNA發卡檢測鏈暴露出的黏性末端完美配對，從而形成更穩定的雜交雙鏈體，并且目標物miRNAs可以釋放以進行下一步結合，從而實現靶標循環擴增檢測。與化學反應中的催化劑相似，目標物miRNAs在整個過程中引發了循環擴增反應的開始，同時又完好地從反應中離開，起到了“催化”的作用。因此，該雙色熒光傳感體系nanoflare可以以1∶的信號輸出而不是1∶1的等效反應比響應miRNAs，可以成功地用于檢測和評估藥物誘導的損傷的腎細胞中低豐度的miRNAs。

圖1 靶標循環放大策略的雙色熒光傳感體系在藥物性腎損傷過程中同時靈敏檢測miRNA-21和miRNA-200c的示意圖[20]

本研究旨在探討經“九蒸九曬”炮制后的制首烏水提物對腎細胞的毒性，通過使用所建立的雙色熒光傳感體系測定腎細胞分泌的和的表達，觀察經炮制后的制首烏對腎細胞的毒性作用。

1 材料

1.1 細胞

RPTEC購自美國ATCC。

1.2 藥材

生何首烏樣品（S0）產地為廣東德慶，年份為2019，經戚進教授鑒定為蓼科植物何首烏Thunb的干燥塊根

1.3 藥品與試劑

無菌PBS溶液（批號KGB50）、胰蛋白酶（批號KGY0012）、DMEM/F12高糖培養基（批號KGM12500H-500）、MTT細胞增殖和細胞毒性測定試劑盒（批號KGA311）購自南京凱基生物科技發展有限公司；胎牛血清（批號F2442）購自美國Sigma公司；PureZOL RNA分離試劑（批號7326880）購自美國Bio-Rad公司；miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（批號MR101-02）、miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix（批號MQ101-02）購自南京諾唯贊生物科技有限公司；其他試劑均為市售分析純。

1.4 儀器

L-80XP型超高速冷凍離心機、Allegra 64R型高速離心機（美國貝克曼庫爾特科學儀器）；低速離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）；EL-x800型酶標儀（美國Bio Tek公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；細胞培養箱、超低溫冰箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）。

2 方法

2.1 不同炮制次數制首烏水提物對細胞毒性的影響

本課題組前期已對生何首烏（S0）完成了從“一蒸一曬”（S1）到“十二蒸十二曬”（S12）的不同次數的炮制，曬蒸的方法參照《中國藥典》2020年版一部（通則0213），每次實驗嚴格控制操作的溫度和時間。本研究使用的是不同炮制次數制首烏的水提物。將不同炮制次數的制首烏水提物分別用無胎牛血清的DMEM/F12培養基稀釋成終質量濃度為1、2、5、10、20、50、100 mg/mL的溶液，經0.22 μm微孔濾膜濾過備用。

RPTEC用含20%胎牛血清的DMEM/F12高糖培養基，于37 ℃、5% CO2進行常規培養。取處于對數生長期的細胞，以1×104/孔接種于96孔板中，每孔200 μL，培養24 h；棄去培養液，分別加入200 μL已配制好的生首烏（S0）和不同炮制次數（S1～S12）制首烏水提物（終質量濃度分別為1、2、5、10、20、50、100 mg/mL）培養24 h，對照組加入不含藥物的培養基，在96孔板上留出一列不接種細胞，作為調零孔（即空白組），并且每種藥物在每個質量濃度下設置至少5個復孔；使用MTT活細胞檢測系統對生首烏和不同炮制次數制首烏水提物處理下的RPTEC活力進行檢測，計算細胞存活率，MTT工作液質量濃度為5 mg/mL，使用Origin 2018軟件繪制質量濃度-細胞存活率曲線。

細胞存活率＝(實驗－空白)/(對照－空白)

2.2 細胞培養基中總RNA的提取

RPTEC以1×107/孔接種于6孔板中，每孔2 mL，培養24 h；棄去培養液，分別用不同炮制次數制首烏水提物（20 mg/mL）孵育24 h，對照組加入不含藥物的培養基，取500 μL上清液，與1 mL PureZOL試劑混合置于RNase-free離心管中，孵育5 min；加入氯仿后充分搖動RNase-free離心管，離心分離上層水相，并將其收集到新的RNase-free離心管中；將異丙醇添加到水相中混合5 min，4 ℃、12 000×離心10 min；將RNA沉淀物用75%乙醇洗滌，4 ℃、7500×離心5 min；吸去乙醇，將純化的RNA重新懸浮于50 μL DEPC水中。

2.3 雙色熒光傳感體系檢測制首烏誘導腎細胞損傷后miRNAs

取50 μL“2.2”項下提取出的細胞培養基中的總RNA，與5 nmol/L雙色熒光傳感體系nanoflare在200 μL的總體積中于37 ℃孵育1 h，待反應溶液冷卻至室溫時，使用熒光酶標儀檢測反應后的恢復的熒光信號強度，通過492 nm波長的激發光激發，收集發射圖譜中518 nm波長出的FAM的熒光強度數據，熒光發射收集范圍為500～660 nm；通過648 nm波長的激發光激發，收集發射圖譜中668 nm波長出的Cy5的熒光強度數據，熒光發射收集范圍為650～760 nm。

2.4 qRT-PCR實驗

使用miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄cDNA樣品。在RNase-free離心管中配制混合液：2 μL 5×gDNA Wiper Mix和8 μL已提取的RNA樣品，吹打均勻后于42 ℃孵育2 min；加入1 μL 2 μmol/L stem-loop primer，2 μL 10×RT Mix，2 μL HiScript II Enzyme Mix和5 μL RNase-free ddH2O，分別依次在25 ℃、5 min，50 ℃、15 min和85 ℃、5 min下進行孵育；產物即為所合成的cDNA鏈，可立即用于qRT-PCR反應，或保存在?20 ℃中用于隨后的實驗。使用miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix對逆轉錄出的cDNA鏈進行qRT-PCR分析，使用2???Ct法計算經不同炮制次數制首烏處理的RPTEC中和的相對表達量。引物序列見表1。

2.5 統計分析

通過Origin 2018軟件對數據進行處理分析，數據以表示，多組間比較采用的是單因素方差分析的方法。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

引物序列 (5’→3’) U6_forwardCTCGCTTCGGCAGCACA U6_reverseAACGCTTCACGAATTTGCGT miR-21_forwardGCGCGTAGCTTATCAGACTGA miR-21_reverseAGTGCAGGGTCCGAGGTATT miR-21_reverse transcriptionGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG- TATTCGCACTGGATACGACTCAACA miR-200c_forwardCGCGTAATACTGCCGGGTAAT miR-200c_reverseAGTGCAGGGTCCGAGGTATT miR-200c_reverse transcriptionGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG- TATTCGCACTGGATACGACTCCATC

3 結果

3.1 不同炮制次數制首烏水提物對腎細胞毒性的影響

本研究通過給予細胞生首烏（S0）和經過12次蒸曬炮制次數（S1～S12）的制首烏水提物，考察以上各水提物對腎細胞的半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50），初步評價腎細胞系用于體外藥物誘導的腎毒性研究的可行性，并根據在生首烏和不同炮制次數制首烏水提物處理下的腎細胞的凋亡情況，確定接下來實驗中所使用的水提物質量濃度。生首烏和不同炮制次數制首烏水提物與腎細胞孵育24 h后，計算不同質量濃度下腎細胞的存活率，使用Origin 2018軟件進行擬合，繪制腎細胞的生存曲線（圖2），得到生首烏和不同炮制次數制首烏水提物對RPTEC的IC50值（表2），隨著何首烏炮制次數的增加，其水提物對腎細胞的IC50值不斷增加，反映出水提物的毒性不斷下降。選擇20 mg/mL的水提物進行后續實驗，使用已經合成的雙色熒光傳感體系nanoflare對生首烏和不同炮制次數制首烏水提物誘導的腎細胞損傷后的靶和的表達進行研究。

3.2 雙色熒光傳感體系用于腎細胞損傷后miRNAs分析

如圖3所示，在使用生首烏（S0）和經過12次蒸曬炮制次數（S1～S12）的制首烏水提物處理后的細胞培養基中，雙色熒光傳感體系可以很明顯檢測到所提取的和表達有不同程度地升高；隨著何首烏炮制次數的增加，FAM和Cy5 2種熒光的恢復強度在不斷減弱，表明其水提物處理后的細胞培養基中的和的含量在不斷減少。并且相比于沒有用藥物處理過的正常RPTEC，經水提物處理后的RPTEC分泌的和的表達整體偏高；同時，觀察到在超過9次炮制次數后，FAM和Cy5 2種熒光的恢復強度的減弱程度減緩，說明炮制超過9次后的制首烏（S9～S12）的毒性減弱的程度相當，也表明雙色熒光傳感體系可以準確地區分正常細胞和經藥物誘導的細胞。

3.3 qRT-PCR分析

使用qRT-PCR檢測和表達的變化，對上述檢測結果的準確性進行驗證。如圖4所示，經生首烏和不同炮制次數制首烏水提物處理的RPTEC培養基中的和mRNA相對表達量出現了不同程度地變化，總體而言，測得的和的表達水平與雙色熒光傳感體系所檢測的結果對應。

圖2 生首烏(S0) 和不同炮制次數制首烏水提物 (S1～S12) 對RPTEC的細胞存活率的影響(, n = 5)

表2 生首烏(S0) 和不同炮制次數制首烏水提物 (S1～S12)對RPTEC的IC50值

Table 2 IC50 values of Polygoni Multiflori Radix (S0) and water extracts of Polygoni Multiflori Radix with different processing times (S1—S12) on RPTEC

水提物IC50/(mg·mL ?1)水提物IC50/(mg·mL ?1) 生首烏（S0）19.82制首烏（S7）28.13 制首烏（S1）21.42制首烏（S8）30.83 制首烏（S2）22.12制首烏（S9）31.53 制首烏（S3）23.52制首烏（S10）33.13 制首烏（S4）24.92制首烏（S11）35.14 制首烏（S5）26.03制首烏（S12）37.44 制首烏（S6）27.33

與對照組比較：**P＜0.01 ***P＜0.001

圖4 qRT-PCR檢測生首烏和制首烏水提液處理的RPTEC培養基中miR-21和miR-200c mRNA的相對表達量

4 討論

中藥炮制是按臨床用藥需求及藥物自身性質，采用一定的方法將中藥材加工成中藥飲片的技術，“九蒸九曬”是中藥材處理中比較常見的炮制手段，常用于何首烏、黑芝麻、地黃、黃精等藥材的處理，從宋代伊始沿用至清代，人們通過使用“九蒸九曬”的方式減小中藥材對人體的毒性[21]。而其中的“九”，除了有“九次”的含義之外，在古語中還泛指“多次”，何首烏是典型的生熟異治的藥材，本研究基于對何首烏傳統炮制方法的考證，針對“九蒸九曬”這一具有特色的炮制方法，研究何首烏炮制過程中毒性的演變規律；同時，關于何首烏的研究主要集中在其對于肝臟的毒性方面，本研究創新性使用新型納米材料納米金與核酸組裝的雙色熒光傳感體系，針對經過“九蒸九曬”炮制后的制首烏水提物對腎細胞的毒性進行了檢測，通過使用所建立的雙色熒光傳感體系測定藥物性腎損傷相關生物標志物和c的表達，觀察經炮制后的制首烏對腎細胞的毒性作用，考察了何首烏經炮制后的腎臟毒性，為具有潛在腎毒性藥物的篩選及機制研究和臨床安全用藥的指導提供了新的方法。

在本課題組的前期工作中，通過構建不同腎毒性藥物的腎細胞體外模型，證明了在腎毒性藥物誘導腎細胞損傷后，細胞培養基中的和的表達出現了不同程度地增加；本研究通過使用所建立的雙色熒光傳感體系測定腎細胞分泌的和的表達，觀察經炮制后的制首烏對腎細胞的毒性作用。首先使用生首烏水提物和本課題組前期已完成“一蒸一曬”（S1）到“十二蒸十二曬”（S12）的不同次數的炮制的制首烏水提物建立腎細胞體外模型，并且根據質量濃度-細胞存活率曲線，選擇合適的給藥質量濃度；其次，使用雙色熒光傳感體系nanoflare成功對給藥前后細胞培養基中的和進行定量檢測，發現伴隨著炮制次數的增加，培養基中測得的和的表達均在一定程度上減少，同時觀察到在超過9次炮制次數后，和的表達沒有顯著性變化。通過比較不同炮制次數的何首烏水提物的腎細胞毒性，可知在炮制過程中毒性逐漸減弱，炮制至第9次時毒性顯著減弱，其后隨著炮制的再進行，對腎細胞的毒性作用變化不大，基本趨于穩定。通過結合qRT-PCR技術對腎毒性生物標志物和的測定，在炮制9次之后，和的表達接近對照組水平，對于何首烏“九蒸九曬”炮制品對腎小管的毒性仍需進一步研究。生首烏毒性很強，而通過“九蒸九曬”后的制首烏基本無毒，表明通過“九蒸九曬”在細胞水平可以達到減毒的作用，未來有望進一步用于活體實驗進行探討，以上研究結果可以為制首烏炮制工藝與質量標準的完善提供一定的參考。

本研究將雙色熒光傳感體系用于探究以炮制后的制首烏為代表的中藥材對腎細胞的毒性作用，旨在探索經炮制處理后的中藥材的毒性變化，因雙色熒光傳感體系的檢測具有普適性，有望用于更多具有潛在腎毒性藥物的篩選及機制的研究中；創新性使用現代新型納米材料AuNPs，結合熒光檢測技術，發展無創、高靈敏、快速響應的熒光傳感器，實現了對何首烏經不同炮制后毒性變化的快速識別；同時，以生首烏和不同炮制次數制首烏的水提物作為模型藥物，可以為更多中藥材在炮制過程中的毒性演變規律研究提供新的方向。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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A dual-color fluorescence sensing system based on target cycle amplification strategy to explore attenuating effect of different steaming times on kidney cells in process of “nine times steaming and nine times sunning” of

GAO Han1, LIU Shi-jia2, PANG Hui-ming2, TIAN Jiang-wei1, QI Jin1

1. School of Traditional Chinese Pharmacy, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China 2. Department of Pharmacy, Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine, Nanjing 210029, China

To detect the expressions ofandsecreted by kidney cells by using the established dual-color fluorescence sensing system, and observe the effects of decrease toxicity of processed Heshouwu () after “nine times steaming and nine times sunning” on kidney cells.After kidney cells being incubated with water extracts of crude and processedwith different preparation times, two-color fluorescence sensor system was used to quantitatively detectandin cell culture media before and after administration.By comparing the toxicity of the water extracts ofwith different processing times, with the increasing of processing times, the fluorescence recovery intensity of two-color fluorescence sensor system was constantly weakened, and expressions ofandin cell culture media treated with water extracts of processedwas reduced, which indicating that toxicity gradually weakened during the processing. The toxicity was significantly weakened at the ninth time, and the toxic effect on kidney cells was not significant, indicating that the toxicity of water extracts of processedto kidney cells was continuously reduced with the increasing of processing times.Rawis toxical, but the toxic of processedis gradually weakened. After processing more than nine times, processedis basically non-toxic, indicating that “nine times steaming and nine times sunning” can achieve attenuation at cell level, which can provide a reference for the improvement of processing technology and quality standards of.

drug-induced kidney injury; microRNAs; target circulating amplification strategy;; toxicity-attenuating effect of processing; nine times steaming and nine times sunning

R285.5

A

0253 - 2670(2022)08 - 2383 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.08.015

2021-12-17

江蘇省中醫藥科技發展專項（2020ZX11）；江蘇省中醫藥管理局科技項目（JD2019SZ14）

高 涵，女，博士生，研究方向為中藥生物技術。E-mail: gaohan71231@126.com

戚 進，男，博士，教授，博士生導師，主要從事中藥分析研究。E-mail: qijin-cpu@cpu.edu.cn

田蔣為，男，博士，副教授，博士生導師，主要從事中藥生物技術研究。E-mail: jwtian@cpu.edu.cn

[責任編輯 李亞楠]