閩東野生金線蓮無菌體系建立與優化研究

施滿容 羅義發

摘要 [目的]研究閩東野生金線蓮無菌體系建立的最佳培養基配方。[方法]以閩東野生金線蓮莖段為試材，通過正交試驗得到無菌的誘導芽體，通過萌發的芽體增殖建立金線蓮的無菌培養體系，篩選出閩東野生金線蓮快繁的最佳培養基配方。[結果]閩東野生金線蓮莖段誘導芽體萌發最適培養基配方為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 1.5 mg/L，與其他配方之間具有極顯著差異;芽繼代增殖培養基配方為MS+ 6-BA 2.0 mg/L+ NAA 0.2 mg/L+KT 1.0 mg/L，且與其他處理間差異極顯著。[結論]誘導芽時應適當提高一定范圍內細胞分裂素類濃度;芽增殖時應適當降低細胞分裂素濃度，細胞分裂素與生長素比值為10倍時有利于芽增殖生長。

關鍵詞 野生金線蓮;無菌體系;閩東

中圖分類號 S567.23? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）07-0096-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.07.022

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on the Establishment and Optimization of the Sterile System of Wild Aoectochilus roxburghii from Eastern Fujian Province

SHI Man-rong， LUO Yi-fa

（Ningde Vocational College， Fuan， Fujian 355000）

Abstract [Objective] To select the most suitable formula for the cultivation of bud inductions for Aoectochilus formosanus from eastern Fujian Province. [Method]The orthogonal experiment utilized the stem of wild Aoectochilus formosanus from eastern Fujian Province as object to obtain sterile bud inductions， which composed the sterile cultivating system through multiplying and figured out the formula of Aoectochilus formosanus that facilitated its generation. [Result]The most suitable formula for the cultivation of bud inductions for Aoectochilus formosanus from eastern Fujian Province was MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 1.5 mg/L，which was significantly different from other treatments;multiplying formula for the subculture of the succession was MS+ 6-BA 2.0 mg/L+ NAA 0.2 mg/L+KT 1.0 mg/L， which was significantly different from other treatments. [Conclusion] Concentration of cytokinins was expected to be raised in certain range during bud inductions;concentration of cytokinins need to be deduced in bud cultivation， and the bud tend to multiply when cytokinins was 10 times higher than auxin.

Key words Wild Aoectochilus formosanus;Sterile system;Eastern Fujian Province

金線蓮是蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，具有藥用、保健和觀賞多重價值。金線蓮喜陰涼、潮濕的環境，要求溫度20～25 ℃，忌陽光直射，主要生長在常綠闊葉林、毛竹林、竹闊混生林下的溝邊、石壁、土質疏松的潮濕地帶。由于金線蓮種子沒有胚乳，只有在真菌共生下，才能促進種子萌發，因此發芽率很低，難以滿足市場需求，組織培養已成為主要繁殖手段。

目前國內許多學者從多個方面對金線蓮組織培養技術進行了研究，郝麗麗等[1]以金線蓮莖尖外植體誘導的腋芽為試材，探討6-芐氨基嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）、玉米素（ZT）和激動素（KT）對金線蓮腋芽增殖的影響;黃勇[2]以滇越金線蓮和花葉開唇蘭2個金線蓮品種果實為外植體進行組織培養，建立并優化了金線蓮組織培養體系;黃碧華[3]以優良觀賞金線蓮莖段、莖尖、葉片為試材，研究其再生植株在不同外源激素配比下的適宜培養基;劉偉等[4]以金線蓮組培苗的莖段和頂芽為外植體進行增殖培養，比較不同基本培養基、細胞分裂素、生長素、添加物等因素對金線蓮生長狀況的影響，篩選最佳增殖培養基;劉潤東等[5]以福建羅源縣野生金線蓮為外植體，進行芽叢誘導、繼代培養、芽分化和根誘導試驗，結果表明，MS基本培養基中附加6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.1 mg/L和ZT 0.02 mg/L，芽叢的誘導率最高可達9592%;王雅英等[6]以試管苗帶節莖段和頂芽為外植體，用正交試驗篩選芽快速增殖的培養基配方;黃淑燕等[7]以福建永安、廣西玉林、臺灣南投不同產地金線蓮幼嫩莖段為外植體誘導叢生芽，通過不同培養基配方的篩選，建立不同產地金線蓮組培快繁體系;何碧珠等[8]以福建省福州市及三明市金線蓮莖段為試驗材料，誘導愈傷組織和原球莖，建立金線蓮的無菌培養體系;楊紅麗等[9]以云南金線蓮莖段為外植體，研究不同的消毒方法和激素水平對組織培養的影響，篩選出合適的培養基配方;陸素君[10]以廣西野生金線蓮莖段為材料進行研究試驗;汪佳秀等[11]以江西野生金線蓮莖段為外植體，分析莖段不同位置、培養基、生長調節劑和添加物對不定芽增殖和幼苗生長的影響，建立金線蓮無菌繁殖體系。目前，有關福建閩東野生金線蓮組培快繁體系建立的研究仍較少。筆者以閩東野生金線蓮莖段為外植體，采用6-BA、NAA、KT 3因素3水平正交試驗篩選最佳芽誘導培養基配方，通過不同激素配比研究對其芽增殖的影響，從而建立無菌快繁體系，旨在為加快閩東金線蓮快繁產業發展提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以從福建省福安市社口鎮采集的野生金線蓮植株莖段為外植體材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的處理。將金線蓮植株用自來水沖洗干凈后去除根、葉，在超凈工作臺上先用75%乙醇浸泡30 s，再用01% HgCl加1滴吐溫消毒液浸泡10 min，無菌水沖洗3～5遍至無泡沫。用消毒濾紙吸干表面水分，切除傷口部分約05 cm，再切成帶有1節1芽約1.0 cm的莖段，平放接種到不同誘導培養基上，進行芽叢誘導。

1.2.2 芽誘導。以MS為基礎培養基，進行3因素3水平正交試驗L 9（34）設計（表1），3次重復。每處理接種10瓶，每瓶接種3個莖段，各處理培養基均加入蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L，香蕉汁100 g/L，pH調至5.8～6.0，培養30 d后統計芽體誘導率（誘導率=誘導芽的外植體數/接種外植體數×100%）。根據結果篩選最佳芽誘導培養方案。培養室溫度（25±2） ℃，光照強度1 500～2 000 lx，光照時間12 h/d。

1.2.3 繼代增殖培養。以最佳培養方案進行誘導所得的芽體作為中間繁殖體，轉接到不同增殖培養基中培養，每瓶接種3個芽體，每種培養基接種10瓶，重復3次。各處理培養基均加入蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L，香蕉汁100 g/L，pH調至5.8～6.0。接種后置于培養室中進行增殖培養，培養30 d后，觀察外植體芽體增殖情況及長勢，確定最佳增殖培養方案。增殖倍數=總芽數/接種數。

1.3 統計分析

應用SPSS 22.0數據分析軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 不同植物生長調節劑配比對芽誘導的影響

金線蓮無菌莖段經30 d培養后，統計萌芽數和誘導率情況，結果見表2。由表2可知，9種培養基均能誘導金線蓮外植體，其中處理⑤誘導率最高，達96.7%;處理⑦芽誘導率最低，僅600%。試驗結果表明：

2.0、3.0、4.0 mg/L 6-BA濃度配比下的誘導率分別為78.9%、84.4%、63.3%，說明芽誘導率隨著6-BA濃度的升高先增大后下降，6-BA濃度太高反而不利于芽誘導。1.5、1.0、0.5 mg/L KT濃度配比的誘導率分別為78.9%、75.6%、72.2%，說明芽誘導率隨著KT濃度的升高而增大。0.1、0.2、0.3 mg/L NAA濃度配比下的誘導率分別為67.8%、82.2%、76.7%，說明芽誘導率隨著NAA濃度的升高先增大后下降。試驗結果表明芽誘導最佳配方是MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 1.5 mg/L。SPSS數據分析結果表明，處理⑤與其他8個處理差異達到極顯著水平。表2結果表明，3種生長調節劑對芽誘導培養影響表現為6-BA>NAA>KT。

2.2 不同植物生長調節劑配比對芽體增殖的影響

金線蓮腋芽接種10 d后，基部腋芽開始突出并明顯增長，30 d后出現大小各異、數目不等的增殖腋芽，繼代增殖結果見表3。由表3可知，金線蓮腋芽增殖培養最佳培養基為MS+ 6-BA 20 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 1.0 mg/L，獲得芽數最多為33個，增殖系數最大，為3.3。SPSS數據分析結果表明，處理①與各組之間差異極顯著。

試驗結果表明，在不同配比的培養基組合中，當NAA、KT濃度相同時，較低濃度6-BA對芽體的增殖起促進作用，隨著6-BA濃度上升，增殖系數反而下降。說明培養基中NAA、KT濃度不變時，只有適量的6-BA濃度才能達到最佳增殖效果。當6-BA濃度保持不變，只變化NAA濃度時，處理1、處理5、處理8增殖倍數相對高于另外2組，說明6-BA與NAA比值大約控制在10倍左右，增殖效果最好。芽體增殖后不轉移繼續培養可以長出不定根，直接成苗。

3 討論與小結

在金線蓮培養過程中，影響腋芽誘導和增殖的一個關鍵因素是培養基中激素濃度的配比。6-BA、NAA和KT是組織培養快速繁殖的3種常用生長調節劑，其使用濃度對芽誘導和增殖的影響很大。劉潤東等[5]對福建省羅源縣采集的野生金線蓮研究結果表明，激素組合6-BA 1.0 mg/L和NAA 0.1 mg/L能誘導芽叢的發生，隨著6-BA和NAA濃度的升高則不利于芽叢的誘導;當6-BA濃度最高為5.0 mg/L、NAA為0.5 mg/L時，誘導材料幾乎全部壞死。何碧珠等[8]研究表明，福建省福州市及三明市金線蓮莖段出芽率隨著6-BA濃度的升高先增大后減小，說明莖段誘導芽體的培養基中6-BA的濃度不宜過高。黃淑燕等[7]研究表明，6-BA濃度對不同產地金線蓮作用效果不同，福建永安金線蓮對6-BA的濃度要求低，而廣西玉林金線蓮對6-BA濃度要求最高。該研究表明，當6-BA增加到4.0 mg/L時誘導率均下降，與以上學者的研究基本一致。通過正交試驗篩選出金線蓮腋芽誘導的最適培養基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 1.5 mg/L，培養30 d后芽誘導率達到96.7%。正交試驗中3種植物生長調節劑對芽誘導的影響表現為6-BA>NAA>KT，這與王雅英等[6]的研究結果一致。

植物組織培養過程中，以芽繁芽的途徑來增殖，遺傳性穩定，是最廣泛應用的途徑之一。該試驗篩選出最佳增殖培養基配方是MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 1.0 mg/L，經30 d培養增殖系數達到3.3。當保持NAA 0.2 mg/L不變，6-BA增加到3.0 mg/L時，6-BA/NAA達到15倍時增殖系數為2.6，6-BA增加到4.0 mg/L，6-BA/NAA達到20倍時，增殖倍數僅為1.6。當NAA 0.3 mg/L時，表現為隨著6-BA濃度升高增殖系數下降;當NAA 0.5 mg/L時，則表現為隨著6-BA濃度升高增殖倍數下降，說明6-BA/NAA比值高不利芽增殖生長，這可能與金線蓮芽體對6-BA有一定的忍耐力有關，在初代培養中芽體中已經積累了一定濃度6-BA，增殖培養時6-BA濃度高反而抑制芽的再分化增殖生長。說明培養基中NAA、KT濃度不變，6-BA濃度過高反而達不到理想的效果，只有適量才能達到最佳增殖效果。這與黃淑燕等[7]的研究結果基本一致，但與何碧珠等[8]的研究結果（NAA濃度一定時芽體的增殖速度隨著6-BA濃度的升高先增加后下降）不一致，這可能與金線蓮產地、培養條件等有關。

在組織培養中，生長素和細胞分裂素的比例決定器官分化，即脫分化時生長素低，細胞分裂素高;再分化時生長素高，細胞分裂低素。該研究結果表明，閩東野生金線蓮莖段脫分化誘導芽時，適當提高細胞分裂素濃度有利于芽誘導;芽增殖時應適當降低細胞分裂素濃度，當細胞分裂素與生長素比值為10倍時，有利于芽增殖生長。

參考文獻

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