越南紫薯組培快繁及FMV病毒檢測

李艷輝 穆玉潔 白冰洋 蔣素華

摘要 [目的]探究獲得大規模的越南紫薯脫毒苗的技術方法。[方法]采用莖尖組織培養快繁技術和RT-PCR技術，探討不同培養基成分對越南紫薯無毒莖尖的誘導、分化、增殖以及生根的影響和羽狀斑駁病毒的檢測，建立越南紫薯高效再生體系和病毒檢測體系。[結果]篩選出最適越南紫薯不定芽產生的培養基是MS+6-BA 1.0 mg/L，最佳增殖培養基為1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+CW 2.0 mg/L，最佳生根培養基為1/2MS+NAA 0.5 mg/L。[結論]該試驗為大田甘薯種苗FMV病毒的高效檢測提供了理論依據。

關鍵詞 越南紫薯;FMV病毒;組織培養

中圖分類號 S531? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）07-0092-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.07.021

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Tissue Rapid Propagation and FMV Virus Detection of Vietnam Ipomoea batatas

LI Yan-hui1， MU Yu-jie1， BAI Bing-yang2 et al

（1. Fengqiu County Agriculture and Rural Affairs Bureau， Xinxiang， Henan 453000;2. Luohe Tiankang Agricultural Development Co.， Ltd.， Luohe， Henan 462000）

Abstract [Objective]To acquire large-scale Vietnam Ipomoea batatas seedings. [Method]This study adopts the tissue of rapid propagation technology，discusses different culture medium components of Vietnam Ipomoea batatas buds reduction，differentiation，proliferation and the influence of root. [Result]The results illustrate that the MS+6-BA 1.0 mg/L was the optimum medium for Ipomoea batatas buds reduction， 1/2MS +6-BA 1.0 mg/L+CW 2.0 g/L was the best medium for Ipomoea batatas proliferation，1/2MS+NAA 0.5 mg/L was the optimum medium for Ipomoea batatas growing roots.[Conclusion]Therefore， this experiment can provide a fundamental theory for virus G detection in the field.

Key words Vietnam Ipomoea batatas;Virus FMV;Tissue culture

病毒病是甘薯的重要病害之一，該病直接影響甘薯的生產量，使其種性退化。據報道，目前世界上甘薯病毒有30余種 [1-3]，其中甘薯羽狀斑駁病毒（FMV）是我國甘薯中檢測到的最普遍的病毒[4]，通常情況下FMV與甘薯褪綠矮化病毒（CSV）交叉感染甘薯[5]。但是兩者對甘薯植株產生的影響不同，FMV主要的生理病癥是破壞葉綠體結構，降解葉綠素，常見的表現癥狀是不規則的萎黃癥狀、褪綠斑以及不規則的羽狀黃化斑，有些病斑外緣通常會有紫色素的產生。據統計，目前發現的甘薯病毒中，對甘薯感染面積最大的病毒是馬鈴薯Y病毒屬，病毒FMV和CSV都是馬鈴薯Y病毒[6]，FMV已被明確指出有多個株系，屬于世界性分布，幾乎所有的甘薯種植區都會有FMV的存在。FMV是長825～850 nm、桿狀彎曲的粒子，是馬鈴薯Y病毒所有病毒中最長的病毒[7-9]，侵染成功率相當高。

甘薯采用無性繁殖進行增殖，病毒會隨植株不斷的增殖，通過塊莖或者秧苗代代相傳，致使甘薯的生產質量不斷下降。國內外研究者致力于甘薯抗病毒育種及甘薯脫毒研究，但至今尚未發現對甘薯病毒病有效的化學預防和治療藥劑，也未發現實用的甘薯品種能夠高抗病毒病[10]。鑒于此，甘薯脫毒苗的大量培養成為提高甘薯產量和質量最有效的方法之一[11]。

甘薯脫毒苗的培養利用甘薯莖尖分生組織是無毒區的原理，將莖尖剝離，并進行組織培養獲得無毒苗的一種生物技術[12-13]。分子生物學檢測法即RT-PCR法，根據待測病毒外殼蛋白的核酸序列設計出特定的引物，提取越南紫薯的總RNA，建立合適的體系反轉錄得到其cDNA，用設計好的引物建立RT-PCR體系對得到的cDNA進行擴增并用普通瓊脂糖進行電泳檢測[8]。該研究利用越南紫薯的莖尖進行快繁，通過RT-PCR檢測獲得真正的無毒薯苗，提高紫薯的生產量，為甘薯病毒檢測及脫毒苗快繁技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采取新鮮越南紫薯葉片，用自來水清洗干凈并放于液氮中速凍，標記后存放于-80 ℃恒溫中備用。

1.2 引物設計

在NCBI上查取SPFMV外殼蛋白（SPFMV-CP）的序列，用Primer premier 5.0 設計序列保守引物，并由上海英駿生物技術公司合成，上引物：FMV-CP-F：5′-TTAGGCAGATTATGACGCA-3′;下引物：FMV-CP-R：3′-GCACACCCCTCATTCCTA-5′。

1.3 PCR擴增與測序

利用TIANGEN公司的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取紫薯的總RNA，用試劑盒M-MLV反轉錄得到cDNA，以得到的cDNA為模板，進行PCR擴增，凝膠回收目的基因，然后進行T載體連接轉化，最后進行基因測序。

1.4 越南紫薯的莖尖脫毒與病毒檢測

1.4.1 脫毒苗的獲得與芽誘導培養。

選取健康無病斑的越南紫薯塊，用清水洗凈表面泥土。先用0.1%高錳酸鉀處理15 min，再用0.5%多菌靈浸泡1 h，撈出晾干，在0.1%多菌靈水中進行恒溫催芽，溫度為28? ℃，相對濕度為80%～85%，待薯芽萌動后，于35～40 ℃處理30 d（8 h/d）。

剪取生長旺盛的甘薯枝條頂芽下3～6節，剪去葉片和葉柄后進行消毒。消毒時先將材料放在水與洗潔精比例為1∶500的溶液中沖洗15 min，流水沖洗30 min，再將枝條剪成至少帶2個頂芽的小段后，再用70%乙醇浸泡40 s。用無菌水清洗干凈后，以0.1%HgCl 2滅菌6～7 min，再用無菌水反復清洗4次。在超凈工作臺上，把小段莖尖頂端的生長點（一般帶有1～2個葉原基）剝離后，插入芽誘導X 1～X 3號培養基中，X 1：MS+6-BA 1.0 mg/L;X 2：MS+KT 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L;X 3：MS。接種15 d后觀察生長情況并統計。

1.4.2 脫毒苗的增殖培養。

選取健壯無菌叢生芽分割成5 mm左右的小段，葉片切成直徑為4 mm左右大小的塊，接種到M 1～M 3號培養基中培養，M 1：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L;M 2：MS+KT 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L;M 3：1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+CW 2.0 mg/L。培養基為120 ℃滅菌30 min。每瓶接種數目一致（4～6個），置于光照培養室進行培養，并觀察叢生芽增殖和長勢情況。

1.4.3 脫毒苗的生根培養與病毒檢測。

選取脫毒成功的越南紫薯增殖苗，切成帶有2～3片嫩葉且2～3 cm的小段，移至Z 1～Z 3號生根培養基中，Z 1：1/2MS+NAA 0.5 mg/L;Z 2：1/2 MS+NAA 0.3 mg/L;Z 3：1/2MS。每瓶接種數目一致，培養20 d，觀察生根情況。當小苗在培養瓶中長到7～9 cm時可進行煉苗和移栽。每株至少摘取1片生根培養后的葉片進行RT-PCR檢測，然后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳及UVITEC成像系統分析電泳結果。若無對應FMV病毒外殼蛋白目標條帶，即可判斷經過莖尖脫毒的株系脫毒成功，并將未脫毒成功的株系淘汰。

2 結果與分析

2.1 總RNA的提取

獲得總RNA溶液后，凝膠電泳檢測其完整性，結果見圖1。從圖1可以看出，18S、28S條帶清晰，且28S條帶為18S的2倍，通過紫外分光光度計檢測其OD值在1.8～2.0，說明提取的RNA完整性較好，可通過PCR進行擴增。

2.2 基因克隆

以獲得的cDNA作為模板，設計好引物FMV-CP-F和FMV-CP-R，用RT-PCR檢測，結果顯示有1條特異性條帶在336 bp（圖2），說明基因片段已經獲得。

2.3 PCR檢測與分析

連接轉化后挑取陽性菌落作為目的基因模板，用引物FMV-CP-F和FMV-CP-R配制PCR體系，經擴增得到300 bp片段（圖3）。

2.4 莖尖脫毒與病毒的檢測

2.4.1 莖尖誘導。

對越南紫薯進行消毒和催芽后，取莖尖生長點接種到芽誘導培養基中進行培養，15 d后觀察培養情況。由表1可知，X 1培養基誘導率達到100%，不定芽生長旺盛，呈深綠色，說明誘導效果好;X 2的誘導率雖然達到970%，但芽呈黃綠色，說明X 2的莖尖誘導效果一般;X 3的誘導率為92.5%，芽較弱，說明誘導效果欠佳。綜合判斷，X 1培養基中的激素適合不定芽的誘導，莖尖誘導情況見圖4。

2.4.2 增殖培養和病毒檢測。

為了避免誘導得到的不定芽老化，在其培養一段時間后，將其及時分成獨立的芽苗接種到新鮮的培養基上，使芽苗能夠快速增殖生長，以滿足生根培養的需求。該試驗采用3種不同的培養基對增殖培養過程進行比較篩選，結果見表2。由表2可知，培養基M 3的增殖效果最好，即培養基1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+CW 2.0 mg/L適合越南紫薯苗的增殖，增殖率達98.9%，且苗生長健壯。增殖培養情況見圖5。

2.4.3 脫毒檢測。

從快繁體系中挑取長勢較好的植株，將其移栽至智能溫室中培養，剪取莖尖，提取脫毒苗的總RNA，進行PCR檢測，判斷其是否含有病毒。從圖6可見，條帶1 明亮，為陽性對照，條帶2、3看不到條帶則證明脫毒成功，可將植株2、3繼續培養，作為獲得無毒苗的材料。

2.4.4 生根培養。

選取未淘汰的無毒紫薯苗，在超凈工作臺上取帶有2～3片嫩葉的短莖轉移到Z 1～Z 3培養基上進行生根培養，結果見表3。由表3可知，越南紫薯嫩苗在Z 1培養基上生根率為100%，且根長而粗，生根效果理想。而Z 2培養基上的生根率雖然也為100%，但植株長勢不好。因此，根誘導最適培養基為Z 1。生根培養情況見圖7。

3 討論

該研究通過比較不同濃度6-BA、NAA、KT等對越南紫薯組培快繁的影響，初步建立了越南紫薯的組培快繁體系。根據該研究結果可知，不同培養基成分在對越南紫薯莖尖的誘導、增殖和生根產生了不同效果：在誘導紫薯莖尖產生不定芽時宜采用MS+6-BA 1.0 mg/L;在進行增殖培養時宜采用1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+CW 2.0 mg/L;在進行生根培養時宜采用1/2MS+NAA 0.5 mg/L，該組合得到的越南紫薯苗適合煉苗和移栽，單純的1/2MS培養基上紫薯苗雖然也能長出根，但根較弱，難以吸收營養物質，不適合煉苗和移栽。綜合說明培養基中添加激素可以促進器官誘導，而不同激素組合對同一種誘導有不同效應。組織培養的過程中根據RT-PCR檢測方法可檢測脫毒苗是否脫毒成功，檢測過程靈敏快捷。

該研究在短時間內可完成越南紫薯植株再生和病毒檢測過程，實現了再生體系的建立，該體系的建立對越南紫薯快速繁殖和規模化生產有著重要的指導意義。根據相關報道，我國每年因甘薯病毒病而造成的損失極大[14]，而高效的莖尖脫毒體系將會大大降低損失，因此推廣優質的甘薯品種病毒檢測體系及莖尖脫毒體系勢在必行。

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