菌絲霉素抗菌肽高密度發酵生產及其特性研究

宋士良 陸克文

摘要 [目的]開發菌絲霉素抗菌肽，以替代抗生素在飼料生產中添加使用。[方法]以高產菌絲霉素畢赤酵母基因工程菌PPle-BC01為供試菌株，在15 L實驗室發酵罐優化發酵工藝的基礎上，通過50 L、5 t、60 t發酵罐高密度發酵工藝進一步優化放大試驗，實現了60 t罐規模的穩定生產。經層析柱分離、純化，得到相對純度≥90%的純品。純品水解后的游離氨基酸樣品，經PITC衍生化處理后，再經過HPLC檢測及氨基酸組成摩爾百分比計算與氨基酸混合標準品比對，分析其氨基酸組成。純品經多肽蛋白質相對分子質量分析測試，測得plectasin單同位素相對分子量。純品經蛋白濃度、抗菌效價測定、比活計算以及產品抗菌效價測定，獲得產品中plectasin含量，同時測試了解其產品特性。[結果]60 t發酵罐穩定3批次試生產發酵液菌體濕重峰值分別為43.34%、43.78%和43.78%，抗菌效價峰值分別為10 566.99、10 986.45和10 788.56 U/mL;噴霧干燥產品收率分別為12.19%、12.30%和12.50%，抗菌效價分別為100 672.10、103 561.20和99 765.50 U/g。3批次試生產產品中plectasin含量分別為2.26%、2.32%和2.24%。純品經檢測符合plectasin由40個氨基酸組成的多肽的理論氨基酸殘基個數值，分子量為4.440 7 kD。產品在95 ℃溫度以下具有良好的熱穩定性;pH? 3.0～9.0具有良好的酸堿穩定性;在0.03%～0.30%豬膽鹽濃度具有較好的膽鹽耐受性;對胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K均具有良好的抗降解性。[結論]發酵終產品收率達10%，產品抗菌效價達8萬U/g以上，產品中plectasin含量達2%以上，實現了60 t罐規模的產業化穩定生產。

關鍵詞 菌絲霉素抗菌肽;高密度發酵工藝;菌絲霉素含量檢測;產品特性

中圖分類號 Q939.92? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）07-0078-10

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.07.019

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on High-density Fermentation Production and Characteristics of Plectasin Antimicrobial Peptide

SONG Shi-liang，LU Ke-wen

（Shanghai Bornsun Bioengineering Co.，Ltd.， Shanghai 201506）

Abstract [Objective]To develop plectasin antimicrobial peplide to replace antibiotics in feed production.[Method]In this study， a high-yield plectasin-producing Pichia pastoris strain PPle-BC01 was used as the experimental strain，the steady production of 60-ton fermenters were realized by the scale-up experiments of high-density fermentation process in 50 L ，5 t and 60 t fermentor that based on the optimization of fermentation process in 15-liter fermentor.The purified sample of plectasin with relative purity above 90% was obtained by chromatographic column separation and purification.The amino acid composition of the purified sample were analyzed by HPLC determination，calculation of molar percentage of amino acid composition and comparison with reference standards for amino acid mixtures after it’s hydrolyzed free amino acid sample and reference standards for amino acid mixtures were derivatized by PITC.The single-isotope relative molecular weight of plectasin was measured by the relative molecular mass analysis of polypeptide proteins.The content of plectasin in spray-dried products were obtained by determining the concentration， antibacterial titer of pure protein and the antibacterial titer of spray-dried products.The characteristics of spray-dried products were known through the property test.[Result]Peak values of wet weight and antibacterial titer of fermentation broths were 4334%，43.78%，4378% and 10 566.99，10 986.45，10 788.56 U/mL，the yield and antibacterial titer of spray-dried products were 1219%，1230%，12.50% and 100 672.10，103 561.20，99 765.50 U/g ，the content of plectasin in spray-dried products were 2.26%，232% and 224%， respectively in stable three batchs trial production of 60-ton fermentors.The purified sample was determined to be composed of 40 amino acids and the molecular weight was 4.440 7 kD.The spray-dried product had good thermal stability under 95 ℃， had good acid-base stability in the pH 3.0-9.0 range，had good tolerance at the salt concentration of 0.03%-0.30% in pig bile，had good anti-degradability to pepsin， trypsin and proteinase K.[Conclusion]The yield of the final spray-dried products reached 10%，the antibacterial titer was over 80 000 U/g，the content of plectasin in spray-dried products was more than 2%.The industrial and stable production of 60-ton fermenters was realized.

Abstract Plectasin antimicrobial peptide;High-density fermentation process;Determination of plectasin content;Product characteristics

2019年7月10日，《農業農村部公告第194號》指出，2020年7月1日起，除中草藥外，飼糧中禁用其他促生長類藥物飼料添加劑。因此，開發替代抗生素的綠色、生態、安全、高效的新型飼料添加劑是我國畜禽養殖業的熱點及重點。益生菌、中草藥、多糖、抗菌肽等無抗藥性、無殘留、毒副作用小，具有良好的市場開發及應用前景，是高效、綠色環保型飼料添加劑[1]?？咕模╝ntimicrobial peptide，AMPs）是由12～50個氨基酸組成的小生物分子肽，是先天免疫系統的重要組成部分，具有分子量小、易溶于水、耐熱性、抗菌譜廣和不易產生耐藥性等特點[2];還具有一定的免疫學活力[3]。因此，開發利用抗菌肽取代傳統抗生素，對提高畜產品品質、推動綠色畜牧業的發展、保障食品安全具有重要意義。目前獲得抗菌肽的方式主要有從生物體內直接分離提純有生物活性的抗菌肽，再對其結構和功能進行研究。這種方法比較煩瑣，且得到的抗菌肽含量普遍很低，不適合規?；a。人工合成抗菌肽。根據已知的抗菌肽基因序列，用化學方法合成抗菌肽。這種方法成本高，不適于普及應用。酶解法。主要是通過將有抗菌活性的蛋白用特定的蛋白酶切割下其有抗菌活性的部分進行純化，繼而得到抗菌肽。這種方法得到的抗菌肽活性較高，但產量低，成本高。利用基因工程菌生產抗菌肽，可以在一定程度上解決這些困難，通過這種方法得到的抗菌肽目的性強，技術上有提高產量的空間，成本低，應用廣，是生產抗菌肽的一條理想途徑[4]。目前用于基因工程的異源表達系統在生產不同大小、折疊和復雜性的異源抗菌肽方面取得了很大的進步，抗菌肽生產的主要表達系統是細菌和酵母表達系統。畢赤酵母是酵母表達系統中應用最廣泛的表達系統[4]。喬瑩等[5]通過Eco31 I限制性內切酶定向連接方法合成大黃魚與美國紅魚抗菌肽Piscidin串聯基因，以畢赤酵母的穿梭表達載體pPICZαA構建重組表達質粒pPICZαA-PSP，轉化入畢赤酵母SMD1168菌株中，實現了PSP重組串聯肽的誘導表達和純化，初步鑒定Piscidin抗菌肽對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和愛德華氏菌等均有抑制生長的活性。鄧贛奇等[6]將優化的目的蛋白堿基序列與標簽MBP基因序列融合，通過雙酶切將重組基因序列插入到畢赤酵母pGAPZaA表達載體上并進行連接反應，成功獲得一種能分泌菌絲霉素的畢赤酵母，對其分泌蛋白進行Western blot檢測、純化、活性分析和質譜鑒定，得到的重組蛋白為55 ku左右，濃度為700 mg/L，純度達80%以上，質譜鑒定結果表明，蛋白序列的覆蓋率達98%，純化后的蛋白對金黃色葡萄球菌具有抑制作用。到該研究實施前為止，重組菌絲霉素抗菌肽尚處于研發階段，國內尚未見產業化報道。通過畢赤酵母表達系統生產抗菌肽是一種有效的生產方法，相對于細菌表達系統生產抗菌肽，表現出更多的優勢。因此，開展重組菌絲霉素基因工程抗菌肽產業化研發具有現實意義。該研究通過高產菌絲霉素畢赤酵母基因工程菌高密度發酵工藝優化及其特性研究，完成菌絲霉素抗菌肽工藝放大試生產、產品試制、試運行，成果轉化達到產業化目標。如何提高基因工程菌絲霉素抗菌肽菌株發酵生物表達量，提高生產效率、降低成本，實現廉價、規?；a，已成為目前抗菌肽研究開發產業化過程中，亟待需要解決的關鍵問題。筆者通過補料高密度發酵工藝優化試驗，并完成菌絲霉素結構、分子量及產品中菌絲霉素成分含量檢測，實現在實驗室15 L發酵罐基礎上發酵菌體鮮生物量提高到400 g/L、抗菌效價表達量提高到8 000 U/mL以上，使發酵終產品收率達10%、產品抗菌效價達8萬U/g、產品中菌絲霉素含量達2%以上，實現60 t罐規模的產業化穩定生產的要求。該產業化成果，經上?？茖W技術情報研究所科技查新，國內外未見有同類研究。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

試驗于2017年1月—2018年12月在上海邦成生物工程有限公司微生物及發酵研究所發酵實驗室及發酵中試、生產車間進行。

1.2 主要儀器

超低溫冷凍柜（DW-86L338J，青島海爾特種電器有限公司）;生物顯微鏡（XSP-BM-2CA，上海彼愛姆光學儀器制造有限公司）;超凈工作臺（YJ-1340，蘇州蘇信環境科技有限公司）;隔水式恒溫培養箱（GHF-9270，上海一恒科學儀器有限公司）;立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-50SⅡ，上海博迅實業有限公司）;冷凍干燥機（TF-FD-1，上海田楓實業有限公司）;分析天平（Sartorius SQP，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）;pH計（PHS-3C，上海雷磁儀器有限公司）;電導率儀（DDS-307，上海雷磁儀器有限公司）;恒溫搖床（TS-211C，常州冠軍儀器制造有限公司）;紫外分光光度計（752N，上海儀電分析儀器有限公司）;實驗室噴霧干燥機（WPG-1500，常州市永昌制粒干燥設備有限公司）;水分測定儀（SYF-6D，深圳冠亞水分儀科技有限公司）;低速臺式離心機（TDL-5-A，上海安亭科學儀器廠）;高速臺式離心機（TCL-18G-C，上海安亭科學儀器廠）;核酸蛋白檢測儀（HD-21-88，上海琪特分析儀器有限公司）;酶標儀（Multiskan MK3，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司）;電熱恒溫水浴鍋（HWS28，上海一恒科學儀器有限公司）;高效液相色譜儀（LC-20AT，日本島津公司）;質譜儀（AB Sciex 5800 MALDI-TOF/TOF，美國愛博才思公司）;實驗室發酵罐（15 L、50 L，上海洋格生物工程設備有限公司）;中試、試生產發酵罐（50 L、100 L、0.5 t、1 t、5 t、10 t、60 t，鎮江東方生物工程設備技術有限責任公司）;壓力噴霧干燥設備（水分蒸發量1 000 kg/h，無錫市現代噴霧干燥設備有限公司）。

1.3 試劑、標準品和測試專用附件

氨基酸混合溶液標準物質（中國北京）購自中國計量科學研究院;濃鹽酸、冰醋酸、無水乙酸鈉（中國上海）購自國藥集團化學試劑有限公司;三乙胺、乙腈、PITC、CHCA、ProteoMass Peptide & Protein MALDI-MS Calibration Kit購自Sigma（美國）;甲醇購自Fisher Scientific（美國）;SA購自Fluka（美國）;SP Sepharose填料購自GE（美國）;2.6 cm×10 cm層析柱（中國上海）購自上海錦華層析設備廠;HL-1B數顯恒流泵（中國上海）購自上海滬西分析儀器廠有限公司;Symmetry C 18色譜柱購自Waters（美國）;氨基酸分析柱（中國北京）購自北京迪科馬科技有限公司;水解管購自CNW Technologies GmbH（德國）;Block Heater（中國上海）購自上海比朗儀器有限公司;樣品靶購自AB Sciex（美國）;BCA蛋白定量分析試劑盒購自Thermo（美國）。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種保藏。

高產菌絲霉素（plectasin）畢赤酵母（Pichia pastoris）基因工程菌PPle，菌株編號BC01。冷凍干燥管、甘油管菌種保藏于上海邦成生物工程有限公司微生物及發酵研究所菌種保藏庫-80 ℃低溫冷凍柜。菌落特征為在YPD平板上，菌落乳白色，平板培養時間較長，泛微黃，菌落光滑圓潤，有酒香。

1.4.2 菌絲霉素基因工程菌構建。

1.4.2.1 基因工程菌構建技術路線?；蚬こ叹鷺嫿夹g路線見圖1。

1.4.2.2 技術路線中關鍵技術。

（1）菌絲霉素是由40個氨基酸組成的多肽，其結構式（即氨基酸組成）為GFGCNGPWNEDDLRCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY。

（2）構建誘導型畢赤酵母基因工程菌株前后酵母發酵過程中生物量的變化情況。

通過構建誘導型高產菌絲霉素畢赤酵母基因工程菌株后，采用實驗室15 L發酵罐，經正交試驗、響應面分析、補料高密度發酵工藝優化，有效提高發酵過程中菌體的生物量，結果發酵液菌體鮮生物量可達300 g/L。

（3）構建誘導型畢赤酵母基因工程菌株前后菌絲霉素表達能力的變化情況。

通過構建誘導型高產菌絲霉素畢赤酵母基因工程菌株后，采用實驗室15 L發酵罐，經正交試驗、響應面分析、補料高密度發酵工藝優化，有效提高發酵過程中發酵液的抗菌效價，結果發酵液抗菌效價可達到6 000 U/mL。

1.4.3 高密度發酵工藝優化試驗

1.4.3.1 50 L罐工藝。培養基：

①固體斜面培養基（W/V）。葡萄糖2.00%，蛋白胨200%，酵母浸粉1.00%，瓊脂200%，pH自然。

②搖瓶種子培養基（W/V）。葡萄糖200%，蛋白胨200%，酵母浸粉1.00%，pH自然。

③50 L罐發酵培養基（W/V）。甘油4.00%，磷酸100%，七水硫酸鎂1.00%，氫氧化鉀0.60%，硫酸銨0.17%，氯化鈉 0.05%，泡敵0.05%，微量元素0.20%，pH 5.0。微量元素（W/V）有硫酸亞鐵6.50%，氯化鋅2.0%，硫酸銅0.60%，碘化鉀0.08%，濃硫酸0.50%，硫酸錳0.30%，氯化鈷005%，鉬酸鈉002%，硼酸0.02%，生物素0.02%（以上培養基均經121 ℃滅菌20 min）。

培養方法：

①固體斜面培養。28～30 ℃培養72 h。

②搖瓶種子培養。取斜面菌種，無菌操作接種1環斜面菌苔，接入已經滅菌處理冷卻，裝有120 mL培養基的500 mL三角瓶中，置搖床以轉速170 r/min、28～30 ℃培養24 h。

③50 L罐發酵。將培養好的二級搖瓶種子液以5%（V/V）的接種量，無菌操作接入已經滅菌處理冷卻、裝有30 L培養基的50 L發酵罐中。培養條件為25～30 ℃，轉速350～750 r/min，風量600～2 500 L/h，罐壓0.02～0.05 MPa。

1.4.3.2 5 t罐工藝。培養基：

①搖瓶種子培養基。蛋白胨20.00 g/L，酵母浸粉1000 g/L。121 ℃滅菌20? min，滅菌完畢后加入終濃度為2000 g/L葡萄糖（115 ℃，15 min單獨滅菌），pH自然。

②50 L罐發酵培養基。一級種子同搖瓶種子培養基。裝液量30 L。

③500 L罐發酵培養基。二級種子同搖瓶種子培養基。裝液量300 L。121 ℃滅菌20 min，滅菌后100 L罐分裝80 L（分裝前100 L罐先進行空罐滅菌處理）。

④5 t罐發酵培養基。甘油40.00 g/L，磷酸10.00 g/L，七水硫酸鎂 10.00 g/L，氫氧化鉀6.00 g/L，硫酸銨1.72 g/L，氯化鈉 0.50 g/L，泡敵0.50 g/L，微量元素0.20 g/L，pH 5.0。微量元素（W/V）有硫酸亞鐵6.50%，氯化鋅2.00%，碘化鉀008%，硫酸銅0.60%，濃硫酸0.50%，氯化鈷0.05%，硫酸錳0.30%，鉬酸鈉0.02%，硼酸0.02%，生物素0.02%。裝液量3 t。121 ℃滅菌20 min，滅菌后1 t罐分裝800 L（分裝前1 t罐先進行空罐滅菌處理）。

發酵條件：

①搖瓶。28～30 ℃，轉速170 r/min，培養周期24 h。

②50 L罐發酵。28～30 ℃，轉速350 r/min，風量40 L/min，罐壓0.02～0.05 MPa，培養周期24 h。

③500 L罐發酵。28～30 ℃，轉速290 r/min，風量25 m3/h，罐壓0.06～0.08 MPa，培養周期24 h。

④5 t罐發酵。25～30 ℃，轉速170 r/min，風量400 m3/h，罐壓0.06～0.08 MPa。

1.4.3.3 60 t罐工藝。培養基：

①搖瓶種子培養基。同5 t罐工藝中搖瓶種子培養基。

②500 L罐發酵培養基。一級種子同搖瓶種子培養基。裝液量300 L。

③5 t罐發酵培養基。二級種子同搖瓶種子培養基。裝液量3 t。121 ℃滅菌20 min，滅菌后1 t罐分裝800 L（分裝前1 t罐先進行空罐滅菌處理）。

④60 t罐發酵培養基。同5 t罐發酵培養基。裝液量30 t。滅菌后10 t罐分裝8 t（分裝前10 t罐先進行空罐滅菌處理）。

發酵條件：

①搖瓶。28～30 ℃，轉速170 r/min，培養周期24 h。

②500 L罐發酵。28～30 ℃，轉速290 r/min，風量25 m3/h，罐壓0.06～0.08 MPa，培養周期24 h。

③5 t罐發酵。28～30 ℃，轉速170 r/min，風量400 m3/h，罐壓0.06～008 MPa，培養周期24 h。

④60 t罐發酵。25～30 ℃，轉速80 r/min，風量3 000 m3/h，罐壓0.06～0.08 MPa。

1.4.4 發酵液噴霧干燥方法。

進風溫度控制在170～190 ℃;出風溫度控制在70～90 ℃;水分蒸發量控制在1 000 kg/h。

1.4.5 菌絲霉素分離、純化方法。

1.4.5.1 樣品處理。

菌絲霉素發酵液→10 000 r/min，4 ℃離心15 min→上清液95 ℃熱處理15 min →冷卻→10 000 r/min，4 ℃離心15 min→收集上清液→等體積加入20 mmol/L pH 6.7的磷酸鉀緩沖液 →加入2倍體積的純水（電導率≤4 mS/cm）→0.45 μm的濾膜過濾→置4 ℃冰箱保存備用。

1.4.5.2 層析柱準備。

10 mL的SP Sepharose FF填料裝入26 cm×10 cm層析柱中，用5倍柱體積的純水平衡柱子，然后用3倍柱體積的20 mmol/L pH 6.7的磷酸鉀緩沖液平衡柱子。

1.4.5.3 純化。

上樣→上樣結束后用3倍柱體積的20 mmol/L pH 6.7的磷酸鉀緩沖液沖洗柱子→然后用3倍柱體積含0.2 mol/L NaCl的20 mmol/L pH 6.7的磷酸鉀緩沖液洗雜 → 再用3倍柱體積含0.5 mol/L NaCl的20 mmol/L pH 6.7的磷酸鉀緩沖液洗脫→收集峰值→最后用3倍柱體積含1 mol/L NaCl的20 mmol/L pH 6.7的磷酸鉀緩沖液沖洗柱子。

1.4.6 菌絲霉素抗菌肽特性。

1.4.6.1 熱穩定性試驗。

菌絲霉素發酵液→分別于40、50、60、70、80、95 ℃水浴加熱15 min → 5 000 r/min離心10 min → 檢測效價。

1.4.6.2 pH穩定性試驗。

產品 → 加水復溶 → 分別將pH調至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0→ 5 000 r/min離心10 min→ 檢測效價。

1.4.6.3 耐膽鹽試驗。

產品 → 加水1∶9復溶 → 分別加入豬膽鹽0.03%、0.10%、0.20%、0.30%、1.00%? → 25 ℃反應4 h → 6 000 r/min離心10 min → 檢測上清液效價。

1.4.6.4 抗蛋白酶降解測試。

產品 → 加水復溶 →調最適pH（胃蛋白酶pH 2.0、胰蛋白酶pH 7.5、蛋白酶K pH 75）→ 按終質量濃度1.0 mg/mL加入3種酶 → 分別水浴40 ℃（胃蛋白酶）、37 ℃（胰蛋白酶）和58 ℃（蛋白酶K）酶解2 h → 調pH至5.9 → 5 000 r/min離心10 min → 檢測效價。

1.5 測定項目與方法

1.5.1 OD 600 nm的測定。

取發酵液，用蒸餾水稀釋至適宜菌濃度，用分光光度計，在600 nm波長處，用比色管定時測定發酵液的吸光度（OD 600 nm），測定時用蒸餾水作空白。

1.5.2 pH的測定。

取一定量的發酵液，用pH計測定發酵液的pH，測定前用標準緩沖溶液校正。

1.5.3 菌體濕重的測定。

取發酵液，將一定體積的待測發酵液（25 mL）倒入離心管中，設定一定的離心時間和轉速（3 000 r/min，15 min），進行離心處理，處理完倒掉上清液并稱重，計算菌體濕重（W/V，%）。

1.5.4 發酵液抗菌效價的測定。

從甘油管中取革蘭氏陽性菌（G+），金黃色葡萄球菌指示菌ATCC25923（Staphylococcus aureus ATCC25923）菌種平板劃線，37 ℃培養過夜，將單菌落接種至無抗LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min培養過夜，將菌液稀釋OD 600 nm至1.0，然后將稀釋菌液按1∶1 000的比例加入溫度不高于50 ℃融化的無抗LB瓊脂培養基中，混勻倒平板，冷卻備用。用Ф2.7 mm打孔器在LB平板上打孔，每皿至少打3個孔，每孔接種5 μL發酵液（使用前吸1.5 mL至2 mL離心管中，10 000 r/min離心5 min，再用0.22 μm過濾器用針筒吸取過濾），用無菌水作空白對照，37 ℃培養過夜。根據抑菌圈大小計算抗菌效價。

計算公式：抗菌效價U（U/mL）=2x×1 000×稀釋倍數，x=（y-2.7）/2.1。

其中，y為抗菌肽抑菌圈直徑（Φmm），取平均值;

2.7為孔穴直徑（Φmm）;

2.1為抗菌肽濃度與抑菌圈直徑的比值常數。

1.5.5 產品抗菌效價的測定。

準確稱取1.000 0 g產品至9 mL無菌生理鹽水中（10倍稀釋），充分振蕩溶解，溶解后吸1.5 mL至2 mL離心管中，10 000 r/min離心5 min，再用0.22 μm濾膜過濾器用針筒吸離心上清液過濾。測定方法同“1.4.4”方法。

計算公式：抗菌效價U（U/g）=2x×1 000×稀釋倍數，其他同“1.4.4”。

1.5.6 菌絲霉素純品純度鑒定方法。

1.5.6.1 純品收集。

在用含0.5 mol/L NaCl的20 mmol/L pH 6.7的磷酸鉀緩沖液洗脫時，共收集10管（每管4～5 mL）;HPLC測得第4～10管菌絲霉素的含量較高，其中第4管含量最高菌絲霉素的峰面積最大，因此單獨保留第4管，進行HPLC法純度鑒定。

1.5.6.2 HPLC法純度鑒定。

流動相A：取1 mL三氟乙酸，加入1 000 mL乙腈，充分混勻。流動相B：取1 mL三氟乙酸，加入1 000 mL純水（電導率≤4 mS/cm），充分混勻。Symmetry C 18色譜柱（250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm），流速1 mL/min，波長280 nm，柱溫35 ℃，進樣量20 μL。

1.5.7 菌絲霉素氨基酸組成分析。

1.5.7.1 純品酸水解。

取一定量純品，轉移至水解管中，加入1 mL 6 mol/L的鹽酸，充入N 2約10 min，之后密封放置于Block Heater干式加熱器模塊中，110 ℃水解反應24 h。反應完畢后，將游離氨基酸溶液轉移至1.5 mL EP管中，抽真空濃縮至干。

1.5.7.2 異硫氰酸苯酯（PITC）衍生方法。

（1）混合氨基酸標準品衍生化處理。取25 μL混合氨基酸標準品溶液，加入12.5 μL 1 mol/L三乙胺渦旋混合振蕩，之后加入12.5 μL 1 mol/L PITC渦旋混合振蕩室溫靜置1 h，加入100 μL正己烷劇烈混合振蕩后靜置10 min，取下層溶液20 μL，加入180 μL流動相A溶液，混合后0.22 μm過濾處理待測試。

（2）純品溶液衍生化處理。取適量流動相A液復溶已凍干樣品游離氨基酸，取25 μL樣品游離氨基酸溶液，其他操作同（1）。

（3）HPLC測試。衍生化好的氨基酸衍生物進行液相色譜測試。A液為0.05 mol/L乙酸鈉水溶液;B液為甲醇乙腈水溶液[甲醇∶乙腈∶水=20∶60∶20（V∶V∶V）]。流速為1.0 mL/min;柱溫35 ℃;色譜柱以95%的A液平衡后，樣品由自動進樣器上樣到氨基酸分析柱。

1.5.8 菌絲霉素相對分子質量分析方法。

1.5.8.1 點樣。

將1 μL純品樣點至樣品靶上，自然干燥后，再取0.6 μL CHCA（Sigma）基質溶液點至對應靶位上并自然干燥，用相同方法在樣品靶位相鄰位置點標準樣。

1.5.8.2 校準。

在正離子模式下，選擇反射方法對樣品測試范圍進行校準測試。

1.5.8.3 相關參數。

標準物質校準范圍為1 046.54±050、1 533.86±0.50、2 465.20±0.50、3 494.65±0.50。

1.5.8.4 測試樣品。

在正離子模式下，選擇反射方法測試樣品分子量。

1.5.8.5 質譜數據及圖譜處理。

5800MALDI-TOF/TOF產生的原始數據及圖譜由4000Series Explorer V3.5軟件導出。

1.5.9 純品的蛋白濃度C 1（mg/mL）測定方法。

采用BCA蛋白定量分析試劑盒法（Thermo Scientific Pierce 23225型）測定。

1.6 數據分析

試驗數據無特別標注均為2次測定值的平均值，數據經過Excel 2016處理后，定量測定數據利用SPSS 21.0統計軟件進行方差分析，差異顯著時采用Duncan’s法進行多重比較，試驗結果以“平均值±標準差（x±s）”表示，顯著性水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 高密度發酵工藝優化試驗

2.1.1 50 L罐試驗結果。

50 L罐發酵過程控制：發酵18～24 h后液體內溶氧（DO）開始上升后定量流加甘油，再補甘油8～10 h，菌體濕重達25%以上。流加完甘油后，開始流加甲醇，5 h后降溫至25 ℃進行維持，利用氨水調節pH 50左右，誘導至下罐。50 L試驗罐進行發酵工藝優化試驗，3批次穩定發酵試驗結果見圖2～4。

從圖2～4可以看出，3批次50 L罐穩定小試發酵試驗，在發酵液達到最高OD 600 nm時，分別取樣測定菌體濕重和抗菌效價，檢測結果見表1。

從表1可以看出，3批次發酵液最高OD 600 nm值相對應的菌體濕重和抗菌效價分別為（43.98±0.52）%、（43.91±008）%、（43.57±0.38）%和（8 736.18±135.76）、（8 226.29±244.66）、（8 286.31±140.01）U/mL;3批次之間菌體濕重和抗菌效價均無顯著差異。

2.1.2 5 t罐試驗結果。

5 t罐中試發酵過程控制：發酵12～18 h后液體內溶氧（DO）開始上升后定量流加甘油，流加甘油8～10 h，菌體濕重達25%以上。流加完甘油后，開始流加甲醇，5 h后降溫至25 ℃進行維持，利用氨水調節pH 50左右，誘導至下罐。5 t罐3批次穩定中試發酵檢測結果分別見圖5～7。

從圖5～7可以看出，3批次5 t罐穩定中試發酵試驗，在發酵液達到最高OD 600 nm值時，分別取樣測定菌體濕重和抗菌效價，檢測結果見表2。

從表2可以看出，3批次發酵液最高OD 600 nm值相對應的菌體濕重和抗菌效價分別為（43.45±0.34）%、（44.45±034）%、（43.88±0.42）%和（10 350.54±438.41）、（10 564.35±328.10）、（11 001.81±202.23）U/mL;3批次之間菌體濕重和抗菌效價均無顯著差異。

2.1.3 60 t罐試驗結果。

2.1.3.1 60 t罐試生產發酵。

60 t罐試生產發酵過程控制：發酵10～14 h后液體內溶氧（DO）開始上升后定量流加甘油，流加甘油8～10 h，菌體濕重達25%以上。流加完甘油后，開始流加甲醇，5 h后降溫至25 ℃進行維持，利用氨水調節pH 5.0左右，誘導至下罐。60 t罐3批次穩定試生產發酵結果見圖8～10。發酵過程發酵液最高菌體濕重和抗菌效價測定結果見表3～5。

從圖8～10及表3～5可以看出，3批次60 t罐穩定試生產發酵試驗，批號20180627發酵64 h菌體生長進入穩定期，菌體積累達到峰值，此時菌體濕重為（43.34±0.27）%;批號20180721發酵67 h菌體生長進入穩定期，菌體積累達到峰值，此時菌體濕重為（43.78±0.40）%;批號20180828發酵65 h菌體生長進入穩定期，菌體積累達到峰值，此時菌體濕重為（43.98±0.38）%。批號20180627發酵64 h發酵液抗菌效價達到峰值，此時抗菌效價為（11 002.12±217.79）U/mL;批號20180721發酵70 h發酵液抗菌效價達到峰值，此時抗菌效價為（11 579.37±147.38）U/mL;批號20180828發酵68 h發酵液抗菌效價達到峰值，此時抗菌效價為（10 820.91±18364）U/mL。菌體濕重與抗菌效價之間相關聯，但并非線性相關關系。

2.1.3.2 ?60 t罐試生產結果。

高產菌絲霉素畢赤酵母基因工程菌PPle-BC01，60 t罐3批次穩定試生產，發酵液及噴霧干燥產品抗菌效價及收率，結果見表6。從表6可以看出，60 t罐3批次穩定試生產發酵液菌體濕重、抗菌效價峰值，噴霧干燥產品抗菌效價之間均無顯著差異。噴霧干燥產品的收率在12%以上。

2.2 菌絲霉素結構、分子量及含量檢測

2.2.1 菌絲霉素純品純度鑒定。

HPLC法鑒定，檢測波長280 nm，檢測結果顯示，菌絲霉素可以在4.756 min的峰處檢測到，純品相對純度≥90%（圖11）。

2.2.2 菌絲霉素氨基酸組成分析。

純品水解后的游離氨基酸樣品，經PITC衍生化處理后，經過HPLC分析，得到的原始數據經過Labsolution（SHIMADZU）經外標法自動積分標峰，所得的標峰圖譜見圖12。

經純品氨基酸組成摩爾百分比計算與氨基酸混合標準品比對，測試結果符合菌絲霉素（plectasin）是由40個氨基酸組成的多肽的理論氨基酸殘基個數值。

2.2.3 菌絲霉素相對分子質量分析。

標準品校準測試通過后，測試純品相對分子質量，純品測試圖譜見圖13。

菌絲霉素（plectasin）是由40個氨基酸組成的多肽，其結構式（即氨基酸組成）的序列是GFGCNGPWNEDDLRCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY。菌絲霉素的理論分子量為4.400 0 kD。圖13質譜圖測得單同位素相對分子量為4.440 7 kD。該分子量與理論分子量相似，因此Plectasin被檢測到。

2.2.4 菌絲霉素含量。

2.2.4.1 純蛋白的比活。

（1）純品的蛋白濃度C 1（mg/mL）測定。

蛋白濃度標準曲線測定結果見圖14。

37 ℃反應30 min，用酶標儀測定492 nm處的吸光度值，測得菌絲霉素純品的吸光度值，計算得到蛋白濃度C 1=（161±0.04）mg/mL。

（2）純品的抗菌效價U 1（U/mL）測定。

在用含0.5 mol/L NaCl的20 mmol/L pH 6.7的磷酸鉀緩沖液洗脫時，共收集10管（每管4～5 mL）;HPLC檢測結果表明，第4～10管菌絲霉素的含量較高，其中第4管含量最高菌絲霉素的峰面積最大，將各管混合后混合液進行抗菌效價檢測，測得混合液的效價U 1=（7 174.12±101.44）U/mL。

（3）純蛋白的比活計算。

純蛋白比活計算公式為RU=U 1/C 1（U/mg）。計算純蛋白的比活RU=U 1/C 1=4 455.98 U/mg。

2.2.4.2 產品抗菌效價。U 0（U/g）測定結果見表6。

2.2.4.3 菌絲霉素含量。

1 g產品中菌絲霉素含量（mg/g）=U 0/RU。60 t罐3批次穩定試生產產品中菌絲霉素含量檢測值分別為批號20180627的1 g產品中菌絲霉素含量U 0/RU=22.59 mg/g，折算百分含量2.26%（W/W）。批號20180721的1 g產品中菌絲霉素含量U 0/RU=23.24 mg/g，折算百分含量2.32%（W/W）。批號20180828的1 g產品中菌絲霉素含量U 0/RU=22.39 mg/g，折算百分含量2.24%（W/W）。

2.3 菌絲霉素抗菌肽產品特性

2.3.1 ?熱穩定性。

熱穩定性測試結果見圖15。

從圖15可以看出，菌絲霉素抗菌肽產品在95 ℃以下抗菌效價無顯著差異，說明其具有較良好的熱穩定性。

2.3.2 pH穩定性。

pH穩定性測試結果見圖16。

從圖16可以看出，菌絲霉素抗菌肽產品在pH 3.0～9.0時抗菌效價測試結果無顯著差異，說明在此pH范圍內具有良好的穩定性（pH 2.0抑菌效價測試結果偏高，應該是酸影響的結果）。

2.3.3 耐膽鹽試驗。

耐膽鹽試驗結果見圖17。

從圖17可以看出，菌絲霉素抗菌肽產品在0.03%～030%膽鹽濃度下抗菌效價無顯著差異，說明其對膽鹽具有較好的耐受性。

2.3.4 抗蛋白酶降解測試。

抗蛋白酶降解測試結果見圖18。

從圖18可以看出，菌絲霉素抗菌肽產品對胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K的抗菌效價無顯著差異，說明其對上述3種蛋白酶均具有良好的抗降解性。

3 結論與討論

3.1 討論

Mygind等[7]首先從腐生子囊菌假黑盤菌菌絲體中克隆到菌絲霉素的cDNA，將其轉化至米曲霉表達系統中，分泌出菌絲霉素，并進行了其結構和活性研究。之后，人們開展了一系列針對菌絲霉菌的研究。Yang等[8]研究表明，菌絲霉素具有強抗革蘭氏陽性菌、無溶血性等作用，可作為一種潛在的治療革蘭氏陽性菌感染的非抗菌素類藥物。王少然[9]在畢赤酵母X-33中融合表達單體Plectasin。將設計的單體基因重組到載體pPICZaA上，轉入畢赤酵母X-33中進行誘導表達，誘導表達120 h后，X-33（pPICZaA/PPD）分泌表達的總蛋白濃度為339 μg/mL，X-33（pPICZaA/PN）分泌表達的總蛋白濃度為307 μg/mL。表達產物經鎳柱純化、化學試劑切割后，進行抑菌活性鑒定，發現切割后獲得的單體PPD和PN均可以抑制金黃色葡萄球菌的生長。萬津[10]將Ple多聚體基因克隆加入畢赤酵母分泌型表達載體pPICZaA，轉化畢赤酵母X-33后得到一株基因工程菌PPle;在1%甲醇誘導下，其表達產物Plectasin能夠有效分泌到培養基中;重組菌絲霉素分子大小約為4.1 kD;在搖瓶中誘導，畢赤酵母基因工程菌PPle分泌水平為143 μg/mL。體外抑菌試驗表明，重組菌絲霉素對豬鏈球菌和金黃色葡萄球菌有強烈的抑制作用，最小抑菌濃度顯示其對豬鏈球菌最為敏感，最小抑菌濃度為4 μg/mL;能從pH 2.0～10.0保持抗菌活性;經胃蛋白酶消化處理后仍能保持較強的抑菌活性。試驗采用60只4周齡健康SD大鼠，按體重相近、雌雄各半原則，隨機分為6個處理，單籠飼養進行動物試驗。分別通過腹腔連續注射重組菌絲霉素、萬古霉素和培養上清液（對照）后，對其中一半大鼠進行金黃色葡萄球菌攻毒（另一半作為對照注射生理鹽水），所有大鼠繼續飼養14 d后宰殺取樣，結果表明，腹腔注射菌絲霉素和萬古霉素均能提高大鼠血清免疫球蛋白含量，改善大鼠免疫功能。葉滔等[11]構建表達菌絲霉素NZ2114蛋白的真核重組表達質粒pPicZα-NZ2114，并轉化畢赤酵母GS115，Zeocin抗性篩選陽性重組子，通過PCR鑒定、Tricine-SDS-PAGE分析和瓊脂孔穴擴散法篩選獲得菌絲霉素NZ2114組成型表達菌株，結果發現在4.4 kD處有明顯的目的條帶，經50 L罐中試發酵，甲醇誘導96 h，菌體濕重達151.23 g/L，菌體細胞數達37億個/mL，蛋白濃度達606 μg/mL，重組轉化子甲醇誘導發酵上清液對金黃色葡萄球菌CMCC26003具有明顯的抑制作用。萬津等[12]采用30 L液體發酵罐對畢赤酵母基因工程菌PPle進行高密度誘導培養，采用分批-補料式發酵工藝和甘油基礎鹽培養基，研究了畢赤酵母工程菌生長及重組蛋白表達規律，并考察了重組菌絲霉素對金黃色葡萄球菌感染大鼠腸道健康和免疫功能的影響。結果表明，在30 ℃下，經甲醇連續誘導72 h，其最大菌體濕重達402 g/L，最高發酵上清蛋白總濃度為3.94 g/L。李延等[13]利用30 L發酵罐對畢赤酵母基因工程菌（PPle）進行液體發酵，采用分批-補料式發酵工藝，比較低鹽、基礎甘油和基礎可溶性淀粉3種不同培養基對重組菌絲霉素分泌表達的影響。結果表明，發酵114 h，低鹽組、基礎甘油組和基礎可溶性淀粉組菌體濕重達到最高，分別為450、402、277 g/L。發酵114 h，測得發酵上清液蛋白總濃度低鹽組0.38 g/L、基礎甘油組3.94 g/L、基礎可溶性淀粉組5.63 g/L。選用30頭24日齡健康的“杜長大”斷奶仔豬，按體重一致原則隨機分配各組進行動物試驗。結果表明，與對照組（無抗飼糧）相比，菌絲霉素抗菌肽能顯著提高ADFI（P<0.05）和ADG（P<0.05），顯著降低F/G（P<005），顯著提高回腸食糜雙歧桿菌的含量（P<0.05），并有降低腹瀉率、提高能量和干物質表觀消化率的趨勢（0.05<P<0.10）。李連彬[14]以牛奶來源的金黃色葡萄球菌為供試菌株，研究菌絲霉素源抗菌肽（NZ2114和MP1102）在培養基、牛奶和奶牛乳腺上皮細胞內的殺菌效果，并選用常規抗生素四環素作對照。結果表明，8株牛奶來源的金黃色葡萄球菌對2種抗菌肽均敏感，2種抗菌肽在牛奶和奶牛乳腺上皮細胞中具有對金黃色葡萄球菌E48高效殺菌能力，且效果優于四環素處理組。通過牛奶源金黃色葡萄球菌誘導小鼠乳腺炎模型，然后據此評估抗菌肽（NZ2114和MP1102）在體內乳腺環境中的殺菌和抗炎效果。結果表明，經過抗菌肽或四環素治療后乳腺組織中金黃色葡萄球菌數量顯著下降，且抗菌肽效果優于四環素（四環素、NZ2114和MP1102分別下降了1.481、2.901和3.151 g單位的數量）。張清娟等[15]研究了菌絲霉素源抗菌肽（NZ2114）對奶牛乳房炎源停乳鏈球菌的體外殺菌效果及其作用機制，結果發現抗菌肽NZ2114對奶牛乳房炎源停乳鏈球菌殺菌活性強，其破壞細菌細胞膜后可直接作用于胞內的基因組DNA并改變其二級結構。Ma等[16]為了評估日糧中添加重組菌絲霉素（Ple）對肉仔雞生長性能、腸道健康和血清免疫參數的影響，開展了288 d的動物試驗，采用1日齡肉仔雞進行飼喂試驗，試驗分4組，包括飼喂基礎日糧（NC），添加10 mg/kg恩拉霉素（PC）、100 mg/kg菌絲霉素（LPle）和200 mg/kg菌絲霉素（HPle）。結果顯示，與NC組相比，Ple能極顯著提高ADG（P<0.01）、顯著降低F/G（21 d，P<0.05），極顯著提高十二指腸脂肪酶（42 d，P<0.01）和胰蛋白酶活性（P<0.01）。與PC組類似，Ple還能提高空腸絨毛高度和隱窩深度（21 d）;與NC組相比，空腸絨毛高度與隱窩深度比值（V/C）極顯著提高（42 d，P<0.01）。PC與Ple均能顯著提高IgG（21和42 d，P<005）和IgM值（42 d，P<0.05）。與NC組相比，PC、LPle和HPle組都能極顯著降低空腸內丙二醛含量（21 d，P<0.01）。此外，Ple還能極顯著降低回腸和盲腸中E.coli和總需氧菌的數量（21和42 d，P<0.01）。

該研究以高產菌絲霉素畢赤酵母基因工程菌PPle-BC01為供試菌株，通過50 L、5 t、60 t發酵罐高密度發酵工藝優化試驗，實現了60 t罐規模的穩定生產，3批次穩定試生產發酵液菌體濕重峰值分別為43.34%、43.78%和43.78%，抗菌效價峰值分別為10 566.99、10 986.45和10 788.56 U/mL;噴霧干燥產品收率分別為12.19%、12.30%和12.50%，抗菌效價分別為100 672.10、103 561.20和99 765.50 U/g。經層析柱分離、純化，得到相對純度≥90%的純品。純品水解后的游離氨基酸樣品，經PITC衍生化處理后，再經過HPLC分析及氨基酸組成摩爾百分比計算與氨基酸混合標準品比對，分析純品在水解過程中，門冬酰胺和谷氨酰胺易轉化為門冬氨酸和谷氨酸，故將其理論個數合并計算;色氨酸、甲硫氨酸和胱氨酸易被破壞;故檢測氨基酸個數與理論個數有所減少，但從氨基酸組成總摩爾百分比計算仍符合Plectasin由40個氨基酸組成的多肽的理論氨基酸殘基個數值。純品經多肽蛋白質相對分子質量分析測試，測得Plectasin單同位素相對分子量為4.440 7 kD，該分子量與理論分子量4.400 kD一致。純品經蛋白濃度、抗菌效價測定、比活計算以及產品抗菌效價測定，計算3批次試生產產品中Plectasin含量分別為2.26%、2.32%和2.24%。產品經性質測試，95 ℃溫度以下具有良好的熱穩定性;pH 3.0～9.0具有良好的酸堿穩定性;在0.03%～0.30%豬膽鹽濃度下具有較好的膽鹽耐受性;對胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K均具有良好的抗降解性。

3.2 結論

該研究以高產菌絲霉素基因工程畢赤酵母PPle-BC01為供試菌株，通過50 L、5 t、60 t罐規模補料高密度發酵工藝優化試驗，并完成菌絲霉素（Plectasin）結構、分子量及產品中含量檢測，實現在實驗室15 L發酵罐基礎上發酵菌體鮮生物量提高到400 g/L，抗菌效價提高到8 000 U/mL以上。發酵終產品收率達10%，產品抗菌效價達8萬U/g以上，產品中Plectasin含量達2%以上，實現了60 t罐規模的產業化穩定生產。

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