枇杷葉提取物對(duì)冷卻肉的保鮮效果

幸曉清,趙楊,司風(fēng)玲*

1(重慶師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,重慶,401331) 2(重慶市公安局高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)分局刑偵支隊(duì)技術(shù)大隊(duì),重慶,401329)

冷卻肉以其獨(dú)特的風(fēng)味、色澤和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,已成為我國(guó)當(dāng)前肉類消費(fèi)的熱點(diǎn)[1]。冷卻肉的儲(chǔ)存周期長(zhǎng)達(dá)7～14 d,但易腐敗變質(zhì),貨架期短且保水性差,而由以上原因?qū)е碌木薮蠼?jīng)濟(jì)損失高達(dá)30億元人民幣。微生物腐敗和脂肪/蛋白質(zhì)氧化是影響冷卻肉品質(zhì)的主要因素,其次不飽和脂肪酸含量較高也極易發(fā)生氧化[2]。脂類在接觸空氣時(shí)極易被氧化,例如在加工肉制品時(shí)的切丁、烹調(diào)和儲(chǔ)存。脂類的氧化程度與豬肉的色澤、保水性和貨架期密切相關(guān),并且決定了冷藏豬肉的感官和營(yíng)養(yǎng)特性[3]。先前的研究發(fā)現(xiàn),脂質(zhì)氧化會(huì)導(dǎo)致肉類和肉制品產(chǎn)生不良的風(fēng)味(酸敗)、質(zhì)地變化和褐色素生成,以及有毒化合物如丙二醛(malonaldehyde,MDA)和膽固醇氧化產(chǎn)物的形成[3]。除了脂質(zhì)氧化外,蛋白質(zhì)的分解還會(huì)導(dǎo)致大量胺的釋放,加速肉類的腐敗。目前,最常見的保鮮方法是將豬肉冷藏在4 ℃左右,在短時(shí)間的低溫冷藏下，可以在一定程度上抑制或減少微生物(包括肉制品中的致病菌、霉菌等[4])的生長(zhǎng)，但仍有一些耐寒細(xì)菌會(huì)繼續(xù)繁殖，進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致冷卻肉腐敗變質(zhì)。

為避免冷卻肉腐敗變質(zhì)所造成的健康威脅和經(jīng)濟(jì)損失,具有清除自由基能力的抗氧化劑被用來(lái)防止肉品質(zhì)的變質(zhì)。低濃度的抗氧化劑可以延緩易氧化生物分子(如肉制品中的脂類和蛋白質(zhì))的氧化,從而提高產(chǎn)品的保質(zhì)期[5]。目前,合成抗氧化劑如丁基羥基茴香醚(butylated hydroxyanisole,BHA)、丁基羥基甲苯(butylated hydroxytoluene,BHT)和山梨酸鉀(potassium sorbate,PS)等因其化學(xué)穩(wěn)定性好、抗氧化活性強(qiáng)、成本低,常被作為保鮮劑應(yīng)用于食品保鮮領(lǐng)域[6]。然而,越來(lái)越多的研究顯示,化合物對(duì)人體健康可能有一定危害[7],這使得天然抗氧化劑逐漸受到人們的關(guān)注與青睞。

近年來(lái),研究者們陸續(xù)開展了含多酚類化合物的天然抗氧化劑對(duì)各類肉制品保鮮效果的研究[8-9]。研究發(fā)現(xiàn),許多植物具有抗氧化活性,包括沙棘葉(Hippophaerhamnoides)[10]、槲寄生(ViscumalbumL.)[11]、櫻桃(Prunuscerasus)[12]、迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)[13]等。植物提取物具有良好的抗氧化性及抗菌功能,這主要是由于其具有不飽和萜烯、醇類、醛類、酸類、酚類和不飽和脂肪族等生物活性物質(zhì)[14]。并且,天然生物活性物質(zhì)不僅具有很強(qiáng)的抗菌和抗氧化活性,還具有抵抗各種人類疾病的潛力[15]。總之,與合成抗氧化劑相比,天然植物抗氧化劑可能更有利于肉類保鮮。

枇杷隸屬于薔薇科枇杷屬,原產(chǎn)于中國(guó)中南部的寒冷山區(qū),也常見于韓國(guó)、日本、印度的丘陵地區(qū)以及巴基斯坦的山麓地區(qū)[16]。枇杷葉已經(jīng)被列入《中國(guó)藥典》(2010版),在中國(guó)和其他東亞國(guó)家中其常被用來(lái)治療感冒、咳嗽、止痰等。研究表明,枇杷葉中含有大量的黃酮類化合物和酚類物質(zhì),并且它的乙醇提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性[17]。另外,枇杷葉提取物也具有較強(qiáng)的抗菌能力。因此,枇杷葉提取物(Eriobotryajaponicaleaves extract,EJLE)是一種安全、健康的天然抗氧化劑。

目前,關(guān)于枇杷葉提取物對(duì)冷卻肉或其他肉制品的保鮮效果的研究較少。因此,本實(shí)驗(yàn)對(duì)冷卻肉在冷藏過(guò)程中脂質(zhì)氧化、微生物的數(shù)量增長(zhǎng)等情況進(jìn)行了評(píng)估,并且研究了EJLE對(duì)冷卻肉菌落總數(shù)(total plate count,APC)、pH值、過(guò)氧化值(peroxide value,POV)、硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物(thiobarbituric acid reactive substance,TBARS)值、總揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)含量等指標(biāo)的影響。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

新鮮豬肉(里脊肉),重慶市沙坪壩區(qū)“新世紀(jì)”超市,當(dāng)天屠宰后冷藏(4 ℃)保持其鮮活狀態(tài),并迅速運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。本研究所用枇杷葉采自重慶師范大學(xué),用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)碾碎后過(guò)30目篩,最后儲(chǔ)存在密封聚乙烯袋中。

沒食子酸、2-硫代巴比妥酸、磷酸緩沖鹽水(PBS)、乙醇,生工生物工程(上海)股份有限公司;無(wú)水碳酸鈉,西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;氯化亞鐵、甲醇,川東化工(重慶)股份有限公司;蒸餾水、超純水,密理博(Millipore)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī),天津市泰斯特儀器有限公司;H01-2數(shù)顯磁力攪拌器,上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司;V1800型可見分光光度計(jì),尤尼科(上海)儀器有限公司;S220-K梅特勒S220-K臺(tái)式酸度計(jì)離子計(jì),梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司;Eppendorf 5430 R離心機(jī),德國(guó)艾本德股份公司;ZXFD-A5140全自動(dòng)新型鼓風(fēng)干燥箱,上海智城分析儀器制造有限公司;XHF-D型高速分散器,寧波新芝生物科技股份有限公司;RE-52AA上海亞榮旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;RaedMax—1800型可見光吸收型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀,上海閃譜生物科技公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 枇杷葉提取物的制備

參照張慧蕓等[13]的方法并稍作改進(jìn),將枇杷葉粉按1∶10(g∶mL)的比例加入V(乙醇)∶V(水)=7∶3的混合物中,在4 ℃下恒溫?fù)u床(100 r/min)24 h。接著在磁力攪拌器中攪拌15 min后用沃特曼濾紙過(guò)濾,收集濾液。使用減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(50 ℃)直至除去乙醇/水混合物后得EJLE產(chǎn)物,置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 樣品(豬肉)處理

將豬肉按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[18]全部切成質(zhì)量不超過(guò)(10±0.2)g的小塊,隨機(jī)分為4組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)包括10塊豬肉。

按照FAN等[18]方法制備4種處理試劑：(1)陰性對(duì)照(不含抗氧化劑negative control,NC);(2)山梨酸鉀(PS,2 mg/g);(3)EJLE,0.5%;(4)BHA/BHT(0.01% BHA + 0.01% BHT),以上均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。將豬肉在這4種溶液中浸泡30 s后,立即取出,用半透性聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)薄膜包裹,置于4 ℃冷藏。分別在貯藏第6、9、12、15、18天時(shí)取樣測(cè)定其pH值、保水性(water holding capacity,WHC)、POV、TBARS、TVB-N和微生物含量。

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 總酚含量

EJLE中總酚含量的測(cè)定按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[19],并做適當(dāng)?shù)男薷摹?.1 mL EJLE與1 mL ddH2O混合后添加0.5 mL福林酚試劑,在混合液中加入1.5 mL 20% Na2CO3和6.9 mL ddH2O,混勻,40 ℃反應(yīng)30 min。反應(yīng)液于765 nm處測(cè)定吸光值。沒食子酸生成量的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.001 7X+0.003 1,(R2=0.998)(線性范圍：60×10-6～ 1 500×10-6),總酚含量以沒食子酸當(dāng)量(gallic acid equivalent,GAE)/EJLE(mg/g)表示。

2.3.2 總黃酮含量

EJLE中總黃酮含量的測(cè)定按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[19],并做適當(dāng)?shù)男薷摹Ｈ〉攘縀JLE與質(zhì)量濃度20 g/L AlCl3反應(yīng)10 min,于415 nm處測(cè)定吸光值。按照同樣的方法,以蘆丁濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.021X+0.036 3,(R2=0.989)(線性范圍：25×10-6～600×10-6)。總黃酮含量用蘆丁當(dāng)量(rutin equivalent,RE)/EJLE(mg/g)表示。

2.3.3 pH值和WHC

準(zhǔn)確稱取10.0 g豬肉,加入100 mL蒸餾水(pH 7.00)進(jìn)行均質(zhì)處理,過(guò)濾后收集濾液,使用pH計(jì)測(cè)量每個(gè)樣品濾液的pH值。

準(zhǔn)確稱量1 g冷藏豬肉(n=3),使用濾紙將3份豬肉分別放入1.5 mL試管中。4 ℃下13 000 r/min離心4 min。離心后置于70 ℃干燥箱中干燥12 h。稱取干燥樣品的質(zhì)量,保水性按公式(1)計(jì)算:

(1)

式中：WHC,保水性,%;m0,初始樣品質(zhì)量,g;m1,離心后樣品質(zhì)量,g;m2,樣品干重,g。

2.3.4 POV

POV的測(cè)定參考文獻(xiàn)[20]所報(bào)道的方法,并做適當(dāng)修改。準(zhǔn)確稱取10 g豬肉樣品與甲醇和氯仿以1∶2∶1(g∶mL∶mL)的比例均勻混合,使用高速分散器均質(zhì)2 min。分別加入90 mL氯仿和蒸餾水,接著繼續(xù)均質(zhì)30 s,過(guò)沃特曼1號(hào)濾紙。1 h后收集濾液的氯仿層,減壓濃縮去除溶劑。得到的濃縮液用于POV值的測(cè)量,樣品POV值以meq/kg表示。

2.3.5 TBARS

TBARS值的測(cè)定按照文獻(xiàn)[21]報(bào)道的方法,并做適當(dāng)?shù)男薷摹?zhǔn)確稱取1 g絞碎均勻的豬肉樣品,分別加入5 mL 0.25 mol/L HCl、5 mL TCA質(zhì)量濃度150 g/L和5 mL 質(zhì)量濃度3.75 g/L TBA,混勻后呈粉紅色。將混合物在100 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)并加熱10 min,取出冷卻后加入1 mL氯仿,5 500 r/min離心25 min。取上清液在532 nm處測(cè)定其吸光值,冷卻肉樣品的TBARS值用MDA含量表示(mg/kg)。

2.3.6 TVB-N

TVB-N含量的測(cè)定按照文獻(xiàn)[22]報(bào)道的方法,并做適當(dāng)?shù)男薷摹?zhǔn)確稱取2 g豬肉樣品在50 mL蒸餾水中均質(zhì)化,隨后加入0.2 g MgO和1 mL 異丙醇。使用半微量蒸餾裝置進(jìn)行蒸餾,0.01 mol/L HCl滴定餾出物。TVB-N含量以每100 g豬肉中含TVB-N 的毫克數(shù)表示。

2.3.7 微生物檢測(cè)

微生物檢測(cè)采取好氧APC,參照國(guó)際食品微生物規(guī)范委員會(huì)(International Committee for Microbiological Standards in Food,ICMSF)的規(guī)定[23]。準(zhǔn)確稱取10 g豬肉樣品在90 mL 0.1%無(wú)菌蛋白胨水中均質(zhì)化。對(duì)勻漿連續(xù)進(jìn)行10倍稀釋,每90 mL蛋白胨水中加入1 mL勻漿。在平板計(jì)數(shù)瓊脂(傾注平板法)上進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂屚坎?37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行APC計(jì)數(shù)。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,差異顯著性采用單因素方差分析(one-way ANOVA analysis),實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05表示差異顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 EJLE總酚和總黃酮含量測(cè)定

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線用于計(jì)算EJLE的總酚含量,約為(32.5±6.21)mg GAE/g。這與早期研究的結(jié)果一致[24],該研究表明肉桂可作為天然抗氧化劑含有大量酚類物質(zhì)。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線用于計(jì)算EJLE的總黃酮含量,約為(24.6±2.99)mgRE/g。常見抗氧化劑,如棕櫚酸、9,12-十八二烯酰氯、亞麻酸等,具有較高含量的酚類化合物和黃酮類化合物,這表明EJLE也具有較高的抗氧化性。

3.2 pH值和WHC

表1顯示了用4種不同方法處理冷卻肉后,在冷藏期間其pH值的變化。結(jié)果顯示,對(duì)照組和處理組的初始pH值均高于6.18。對(duì)照組(NC)中,冷藏15 d后的pH值由(6.22±0.15)下降到(4.87±0.08),冷藏18 d后的pH值為(5.99±0.11)。pH值的降低(P<0.05)反映了豬肉中游離氨基酸因蛋白質(zhì)分解而變質(zhì)的程度,從而會(huì)導(dǎo)致NH3和胺、堿性化合物的形成[9]。隨后pH值呈上升趨勢(shì),這與其他文獻(xiàn)的報(bào)道相似[25]。與對(duì)照組相比,EJLE處理后的樣品其pH值存在顯著差異。并且添加抗氧化劑對(duì)冷卻肉的pH值有一定影響(P<0.05)。

脂質(zhì)氧化會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)氧化,反之亦然[26];因此,豬肉的保水性和剪切力可能會(huì)因脂質(zhì)氧化程度而變化。如表1所示,4種不同方法處理冷卻肉后,在冷藏期間其保水性差異并不顯著(65%～75%)。與測(cè)得的脂質(zhì)氧化相比,蛋白質(zhì)氧化程度并不高。而就目前的研究來(lái)看,脂質(zhì)氧化代謝產(chǎn)生的自由基是促進(jìn)蛋白質(zhì)氧化的唯一因素[27-28]。因此,EJLE可以延緩豬肉冷藏過(guò)程中pH值的升高以及保水性的降低。

表1 EJLE、BHT/BHA、PS對(duì)冷卻肉在4 ℃貯藏過(guò)程中pH和WHC的影響Table 1 Effect of EJLE,BHT/BHA,PS on pH and WHC of chilled pork during storage at 4 ℃

3.3 抗脂肪酸氧化

POV和TBARS可以反映肉制樣品中一級(jí)氧化分解產(chǎn)物和二級(jí)氧化分解產(chǎn)物的含量。表2顯示了4種不同方法處理冷卻肉后,在冷藏期間其POVs和TBARS值的變化。冷藏第0天,POVs和TBARS值分別為0.49 ～ 0.54 meq/kg和0.020 ～ 0.025 mg/kg。冷藏第18天(儲(chǔ)存結(jié)束)時(shí),POVs值為1.93～2.64 meq/kg,而TBARS值為0.604～0.932 mg/kg。POV和TBARS明顯升高代表脂質(zhì)氧化程度減緩,即EJLE具有較強(qiáng)的抗脂質(zhì)抗氧化活性。

整個(gè)貯藏期間,EJLE、BHT/BHA和PS處理后的豬肉樣品其POV值均低于NC,在第15天的大小順序?yàn)镹C>PS>EJLE>BHA/BHT(P<0.05)。POV值的降低表明處理后的豬肉樣品其初級(jí)氧化產(chǎn)物較對(duì)照組少,這可能是由于EJLE中存在酚類、黃酮類等可以阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng),進(jìn)而阻礙豬肉樣品的脂質(zhì)氧化。由表2可知,與處理組相比,NC在貯藏第6天其TBARS值達(dá)到冷卻肉國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)允許的最高值,即0.225 mg/kg(P<0.05)。另外,與NC相比,EJLE、BHT/BHA和PS處理后的豬肉樣品其TBARS值均有所降低(26.3%～35.2%),大小順序?yàn)镹C>EJLE>PS>BHA/BHT(P<0.05)。較高的TBARS值可能是由于水活性值較低時(shí)脂質(zhì)氧化有所增加所致[29]。據(jù)報(bào)道,在TBARS值大于1 mg/kg的肉制樣品中會(huì)檢測(cè)到酸味[30]。一般來(lái)說(shuō),在儲(chǔ)存期間,豬肉樣品的TBARS值升高(P<0.05)意味著醛不斷產(chǎn)生。而抗氧化劑是通過(guò)酚基提供氫來(lái)破壞自由基氧化鏈,進(jìn)而終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)并形成穩(wěn)定的終產(chǎn)物。結(jié)果與文獻(xiàn)中所報(bào)道的一致,合成和天然抗氧化劑對(duì)控制肉制品中的脂質(zhì)氧化均有一定效應(yīng)[31]。MCBRIDE等[32]發(fā)現(xiàn)迷迭香提取物(0.1%)在降低儲(chǔ)存牛肉樣品的脂質(zhì)氧化方面比BHA/BHT或VE更有效。

表2 EJLE、BHT/BHA、PS對(duì)冷卻肉4 ℃貯藏過(guò)程中POV和TBARS的影響Table 2 Effect of EJLE,BHT/BHA,PS on POVs and TBARS in chilled pork during storage at 4 ℃

3.4 TVB-N

TVB-N是衡量肉或肉制品新鮮度的重要指標(biāo),它也被認(rèn)為是細(xì)菌生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)變質(zhì)分解的重要指示信號(hào)[33]。FIELD等[34]研究發(fā)現(xiàn)食物中的酶和微生物可以將蛋白質(zhì)分解成肽和氨基酸。肉制品中的蛋白質(zhì)在貯藏過(guò)程中的分解對(duì)揮發(fā)性化合物的形成有很大影響,最終會(huì)導(dǎo)致TVB-N值升高。如表3所示,整個(gè)貯藏期間,EJLE、BHT/BHA和PS處理后的豬肉樣品其TVB-N值均有所增加。其中,NC組的TVB-N值最高(P<0.05),BHT/BHA組的TVB-N值最低。因此,與NC相比,其貨架期延長(zhǎng)了12 d。總之,以上結(jié)果顯示出EJLE可以延緩豬肉在冷藏過(guò)程中TVB-N值的升高。

表3 EJLE、BHT/BHA、PS對(duì)冷卻肉4 ℃貯藏過(guò)程中揮發(fā)性鹽基氮的影響 單位：mg/g

3.5 抑菌試驗(yàn)

如表4所示,隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng),各組冷卻肉樣品的菌落總數(shù)均顯著增加(P<0.05)。從第6天開始，在相同的冷藏時(shí)間，EJLE處理組的微生物數(shù)量增長(zhǎng)顯著低于BHT/BHA和PS對(duì)照組(P<0.05),主要是由于高溫下微生物的直接破壞[34]以及微生物的代謝損傷[35]。例如,BHT/BHA和PS處理組在其初期的總平板計(jì)數(shù)顯著降低(P<0.01)。冷卻肉在整個(gè)貯藏期間的微生物數(shù)量呈上升趨勢(shì),這可能與pH值、TBARS值的增加有關(guān)。KEMP等[36]也發(fā)現(xiàn)微生物數(shù)量有類似的增長(zhǎng)趨勢(shì)。有研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)新鮮水牛肉中的細(xì)菌數(shù)量超過(guò)8 lg CFU/g時(shí)就會(huì)出現(xiàn)腐敗[37]。然而,在冷卻肉的加工和儲(chǔ)存過(guò)程中,其細(xì)菌數(shù)量約在2～5 lg CFU/g時(shí)就會(huì)檢測(cè)到腐敗。總之,結(jié)果表明,EJLE具有長(zhǎng)期有效的抗菌活性。

表4 EJLE、BHT/BHA、PS對(duì)冷卻肉4 ℃貯藏過(guò)程中需氧細(xì)菌總數(shù)的影響 單位：lg CFU/g

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了EJLE對(duì)冷卻肉在冷藏期間品質(zhì)變化的影響。結(jié)果表明,EJLE含有大量的酚類化合物,具有較強(qiáng)的清除自由基活性。與對(duì)照組相比,經(jīng)EJLE處理后的豬肉在冷藏過(guò)程中對(duì)脂質(zhì)氧化具有較強(qiáng)的抑制作用(P<0.05)。與BHT/BHA和PS相比,EJLE對(duì)冷卻肉的pH值、WHC、POV值和TBARS值均有一定抑制作用。但是,與其他處理組相比,合成抗氧化劑BHT/BHA和PS對(duì)冷卻肉TVB-N值的抑制效果最好。

綜合各評(píng)價(jià)指標(biāo),天然草本植物EJLE可以作為潛在的抗氧化劑,減緩冷卻肉的氧化酸敗,并且不會(huì)對(duì)感官特性產(chǎn)生任何有害影響。