強化曲的制備及其在醬香型白酒中的應用

崔東琦,羅小葉,班世棟,黃武,章鈺浛,趙皓靜,王曉丹*

1(貴州大學 釀酒與食品工程學院,貴州 貴陽,550025) 2(貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州 貴陽,550025)

醬香型白酒釀造工藝復雜,具有“四高兩長”的特點。高溫制曲是醬香酒白酒釀造工藝中最關鍵的環(huán)節(jié),高溫大曲中微生物的種類、數(shù)量、結(jié)構(gòu)等直接決定著白酒的產(chǎn)量和質(zhì)量。

隨著測序技術的發(fā)展,人們對酒曲和發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化有了更深入的了解,在此基礎上,通過分離和篩選功能菌種制備強化曲,以強化酒曲性能、改善白酒品質(zhì)得到廣泛關注。WANG等[1]在大曲中強化添加地衣芽胞桿菌,結(jié)果發(fā)現(xiàn)芳香化合物和吡嗪類物質(zhì)含量顯著提高。盧君等[2]在白酒釀造過程中,利用菌種強化和工藝優(yōu)化相結(jié)合的方式,將醬香型白酒基酒中四甲基吡嗪含量提高了202.75%。崔香香等[3]將分離得到的謝瓦散囊菌CICC 41584應用到濃香型白酒大曲生產(chǎn)中,通過固態(tài)發(fā)酵發(fā)現(xiàn)該菌株能夠顯著提升白酒大曲中關鍵風味成分。SU等[4]從糟醅中篩選到2株功能酵母并將其應用于小曲酒生產(chǎn)中,發(fā)酵結(jié)束時,酸、醇的含量分別提高了42.5%和11.8%。因此,強化曲在白酒釀造過程中具有廣闊的應用前景。

本試驗利用3株酵母菌和2株細菌分別制備強化曲,添加至六輪次生產(chǎn)攤晾后的糟醅中進行強化發(fā)酵,通過檢測分析酒醅理化指標和揮發(fā)性成分動態(tài)變化,探究利用功能微生物制備強化曲對固態(tài)發(fā)酵的影響,從而為利用強化曲在白酒酒質(zhì)提升方面的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種

試驗菌種信息如表1所示。

表1 供試菌株明細Table 1 Details of strains used in this experiment

1.2 試驗試劑和儀器

1.2.1 主要試劑

2-辛醇,德國Dr.Ehrenstorfer GmbH;鹽酸、硫酸、NaOH,分析純,重慶川東化工集團有限公司;葡萄糖、NaCl,分析純,成都金山化學試劑有限公司;次甲基藍、KH2PO4,分析純,天津科密歐化學試劑有限公司;麥芽汁肉湯培養(yǎng)基,MRS肉湯培養(yǎng)基,上海博微生物科技有限公司;瓊脂粉,北京索萊寶科技有限公司。

1.2.2 主要儀器

FA2004 N電子天平,上海菁海儀器有限公司;ZQP-75G臺式全溫振蕩培養(yǎng)箱,天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司;JJ-CJ-1FD潔凈工作臺,蘇州市金凈凈化設備科技有限公司;YXQ-100A立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;E-201-C-9型pH計,上海鴻蓋儀器有限公司;Agilent 7890A GC-5975C MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-WAX(30 m×250 μm×0.25 μm)毛細管色譜柱,美國Agilent公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭,美國Supelco公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 強化曲的制備

按如下流程制備強化曲:

種子液制備：將保藏的功能菌種在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上接種純化,酵母在30 ℃培養(yǎng)1 d,無菌接種到100 mL無菌麥芽汁培養(yǎng)基,30 ℃ 160 r/min培養(yǎng)24 h,制備種子液;細菌在37 ℃培養(yǎng)2 d,無菌接種到100 mL無菌麥芽汁培養(yǎng)基,37 ℃ 160 r/min培養(yǎng)24 h,制備種子液。

種子液擴培：稱取1 kg 麥芽糖,6 L 沸水,將麥芽糖與水按照1∶6(g∶mL)混合,攪拌均勻后,轉(zhuǎn)移至卡氏罐中,于 121 ℃ 下滅菌20 min,冷卻至室溫,加入10%(體積比),微充氧,培養(yǎng)2～3 d。

強化曲制備：取麩皮0.5 kg,加300 mL自來水,攪拌均勻,滅菌,曲盤滅菌,滅菌麩皮均勻分散在曲盤中,在無菌操作臺冷卻,接種細菌或酵母種子液大約100 mL,用無菌玻璃棒混合均勻,放入已經(jīng)殺菌的培養(yǎng)箱,30 ℃培養(yǎng)1 d,打開培養(yǎng)箱門0.5～1 cm排濕,1 d后麩曲干燥,裝袋備用。

理化指標測定：麩皮和強化曲的水分、酸度、淀粉含量、氨基酸態(tài)氮、酯化力等理化指標均依據(jù) QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》進行測定;酸性蛋白酶酶活測定方法參考 SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》,糖化酶酶活力測定采用DNS法[5],纖維素酶酶活測定參考趙玉萍等[6]的方法,脂肪酶酶活測定方法參考國標GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》。

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵試驗

將制備好的強化曲運送至茅臺鎮(zhèn)某酒廠,在六輪次生產(chǎn)中進行固態(tài)發(fā)酵試驗。分別取攤晾后的酒醅20 kg,按m(強化曲)∶m(普通曲粉)=1∶5的比例添加強化曲和生產(chǎn)用曲,攪拌均勻,裝入麻袋中,封口,堆在堆子中上部進行堆積發(fā)酵,堆積發(fā)酵結(jié)束后移入窖池中上層進行窖池發(fā)酵。在堆積前、堆積后、開窖后取樣測定理化指標、揮發(fā)性風味物質(zhì)。

酒醅的水分、酸度、還原糖依據(jù) T/CBJ 004—2018 《固態(tài)發(fā)酵酒醅通用分析方法》測定,酒醅氨基酸態(tài)氮依據(jù)GB 5009.235—2016 《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》測定。

1.3.3 樣品中揮發(fā)性風味物質(zhì)的檢測

樣品預處理：準確稱取5.0 g 待檢測樣品置于20 mL頂空瓶中,加入5 μL 2-辛醇溶液(0.822 mg/mL),迅速擰緊瓶蓋密封。在45 ℃恒溫條件下,160 r/min平衡10 min。

氣相色譜-質(zhì)譜檢測：樣品中揮發(fā)性物質(zhì)采用氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測。色譜條件:色譜柱為DB-WAX(30 m×250 μm×0.25 μm)毛細管色譜柱;進樣口溫度為250 ℃;升溫程序：初始溫度40 ℃,以1 ℃/min 升到45 ℃,保持2 min,以3 ℃/min 升到84 ℃,保持2 min,以3 ℃/min升到120 ℃,保持3 min,以3 ℃/min 升到200 ℃,以5 ℃/min升到230 ℃,運行時間71.667 min。質(zhì)譜條件：電離方式為電子電離源,離子源溫度230 ℃,電離能量70 eV,質(zhì)量掃描范圍20～350 u。

各色譜峰的質(zhì)譜圖結(jié)果經(jīng)NIST11.L標準物質(zhì)質(zhì)譜圖進行比對,篩選相似度>80的物質(zhì)進行定性,各揮發(fā)性風味物質(zhì)成分的相對百分含量使用峰面積歸一化計算,按公式(1)計算：

(1)

式中：S組分,組分峰面積;m內(nèi)標,內(nèi)標物質(zhì)量;S內(nèi)標,內(nèi)標物峰面積;m樣品,樣品質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 強化菌產(chǎn)酶特性及其對麩曲理化指標的影響

實驗測定5種單菌強化曲的酸性蛋白酶、糖化酶、纖維素酶和脂肪酶活力,結(jié)果如表2 所示。5株強化菌均產(chǎn)糖化酶,糖化酶活力在(80.64±0.02)～(120.96±0.03) U/g,差異不顯著,這表明5種強化菌產(chǎn)糖化酶的能力相差不大;5種強化菌只有FBKL 1.0199產(chǎn)蛋白酶,活力為(26.88±0.03) U/g,這表明細菌FBKL 1.0199分解蛋白質(zhì)的能力比另外4種強化菌強;產(chǎn)纖維素酶的強化菌有FBKL 2.0117、FBKL 1.0122、FBKL 1.0199,其中FBKL 1.0199的產(chǎn)纖維素酶能力最強,為(4.53±0.90) U/g,FBKL 2.0117、FBKL 1.0122的纖維素酶活力差異不顯著;產(chǎn)脂肪酶的強化菌有FBKL 2.00K8、FBKL 2.0117、FBKL 2.0130,三者酶活力差異不顯著,表明3種強化菌的產(chǎn)脂肪酶能力相近。

表2 強化曲水解酶系活力 單位:U/g

對未添加強化菌的麩皮以及5種單菌強化曲的理化指標(水分、酸度、淀粉含量、氨基酸態(tài)氮含量、酯化力)測定結(jié)果如表3所示。麩皮及5種單菌強化曲的水分含量由大到小依次為:麩皮>FBKL 2.00K8>FBKL 2.0130>FBKL 2.0117>FBKL 1.0122>FBKL 1.0199,其中強化曲FBKL 1.0199的水分含量最低,這可能與其豐富的酶系有關,FBKL 1.0199代謝產(chǎn)生的各種酶需要以水分為介質(zhì)分解原料中的各種大分子物質(zhì),造成強化曲FBKL 1.0199的水分含量最低[7]。有研究表明,醬香大曲中的核心菌群Bacillus能夠產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶等物質(zhì),與水分呈負相關[8-9]。未添加強化菌的麩皮與5種強化曲的酸度為FBKL 1.0199>FBKL 2.00K8>FBKL 2.0117>FBKL 1.0122>麩皮>FBKL 2.0130,其中強化曲FBKL 2.0130的酸度最低,這可能因為酵母FBKL 2.0130不產(chǎn)蛋白酶,分解蛋白質(zhì)產(chǎn)氨基酸能力弱,且生長代謝需要消耗大量氨基酸,造成強化曲FBKL 2.0130的酸度最低。未添加強化菌的麩皮與5種強化曲的淀粉含量為:麩皮>FBKL 2.0117>FBKL 2.0130 FBKL 1.0122>FBKL 2.00K8>FBKL 1.0199,5種強化曲的淀粉含量比地方標準 DB 52/T 872 規(guī)定偏高,這可能與5種強化曲的糖化酶活力有關,糖化酶活力越高,原料中淀粉利用率越高,強化曲的糖化酶活力低,淀粉含量偏高。有研究表明,霉菌對大曲的糖化力影響較大[10]。

酯化力、氨基酸態(tài)氮含量是反映曲粉品質(zhì)的重要指標。試驗制得的5種強化曲酯化力在(52.07±0.27)～(146.73±0.23) U,酯化力反映了曲粉的產(chǎn)香能力;氨基酸態(tài)氮含量在(0.66±0.01)～(3.21±0.16) g/kg,這與微生物數(shù)量和代謝有著密切的關系。

表3 強化曲的理化指標Table 3 The physical and chemical indicators of fortified Daqu

本實驗 5 種強化曲由5種強化菌制備而成,因此強化曲的理化指標及酶活力存在差異。水分含量的差異反映了強化菌的生長代謝及產(chǎn)酶特性;酸度、氨基酸態(tài)氮含量的差異反映了強化菌的有機酸代謝能力和脂肪、蛋白質(zhì)的分解能力[11],如強化菌FBKL 1.0199蛋白酶活力高,相對應酸度、氨基酸態(tài)氮含量也高。這些差異反映了不同強化菌制備的強化曲品質(zhì)具有差異性。

2.2 強化曲對酒醅理化指標的影響

如圖1-a所示,堆積發(fā)酵、入窖發(fā)酵期間,空白對照組、添加FBKL 2.0117、FBKL 1.0199強化曲粉的酒醅水分含量逐漸升高,至開窖時分別為53.75%、54.96%,而添加FBKL 2.00K8、FBKL 1.0122、FBKL 2.0130強化曲粉的酒醅水分含量波動較大,至開窖時水分含量分別為51.08%、51.79%、52.50%。添加不同單菌強化曲的酒醅水分含量變化趨勢的差異,可能與微生物繁殖代謝產(chǎn)生與消耗水分速率不同有關。

如圖1-b所示,隨著堆積發(fā)酵、入窖發(fā)酵的進行,酒醅的酸度逐漸上升,至開窖時達到最大,添加強化曲FBKL 2.00K8、FBKL 2.0117、FBKL 1.0122、FBKL 2.0130、FBKL 1.0199的酒醅的酸度分別為4.0、3.9、4.0、4.0、4.4和4.1 mmol/(10 g),與空白對照組變化趨勢一致。

如圖1-c所示,在堆積發(fā)酵期間,還原糖含量急劇下降,入窖發(fā)酵后,還原糖含量逐漸上升,與空白對照變化趨勢一致。堆積發(fā)酵期間,酵母菌大量繁殖,生長代謝消耗還原糖,還原糖含量下降;入窖發(fā)酵后,酵母繁殖速率減慢,還原糖消耗速率減慢,且伴隨著淀粉水解生成還原糖,還原糖含量逐漸上升。

如圖1-d所示,添加強化曲FBKL 2.00K8、FBKL 2.0117、FBKL 2.0130的酒醅和空白組酒醅中氨基酸態(tài)氮含量變化趨勢相同,在堆積發(fā)酵期間,酵母大量增殖,氨基酸態(tài)氮消耗速率大,且蛋白質(zhì)分解速率慢,含量有所下降;入窖發(fā)酵后,厭氧環(huán)境中酵母生長受到抑制,氨基酸態(tài)氮積累,含量升高;添加FBKL 1.0122、FBKL 1.0199的酒醅中蛋白質(zhì)分解速率快,氨基酸態(tài)氮含量逐漸升高。

a-水分含量;b-酸度;c-還原糖含量;d-氨基酸態(tài)氮圖1 不同發(fā)酵階段酒醅理化指標Fig.1 Physical and chemical indicators of fermented grains at different fermentation periods注:不同字母表示同組數(shù)據(jù)在不同時期差異顯著,P<0.05

2.3 強化曲對酒醅中揮發(fā)性成分的影響

2.3.1 強化曲對酒醅中揮發(fā)性成分種類影響

通過測定不同發(fā)酵階段酒醅的揮發(fā)性成分含量,可以更好地了解微生物群落變化對釀造的影響。本文以HS-SPME-GC-MS技術,檢測堆積發(fā)酵前、堆積發(fā)酵后、開窖時酒醅中揮發(fā)性成分,酒醅中共檢測到45種揮發(fā)性成分,其中包含12種酯類物質(zhì)、10種醇類物質(zhì)、6種醛類物質(zhì)、5種酸類物質(zhì)、3種烯烴類物質(zhì)、2種吡嗪類物質(zhì)和7種其他類物質(zhì)。

由圖2-a可知,細菌類強化曲在堆積前、堆積后、開窖時揮發(fā)性成分種類分別為41種、36種、32種,在堆積前酒醅共有的揮發(fā)性成分有19種,空白對照組酒醅中有8種特有成分,為鄰異丙基甲苯、苯甲醚、壬醛、2,3,5-三甲基吡嗪、異丁酸、5-甲基呋喃醛、丁二酸二乙酯、萜品烯,添加強化曲FBKL 1.0122的酒醅中有2種特有成分,為庚酸乙酯、1-乙基環(huán)己醇,添加強化曲FBKL 1.0199的酒醅中有6種特有成分,為丁酸乙酯、戊酸乙酯、環(huán)辛四烯、乙偶姻、乙酸苯乙酯和己酸;堆積后酒醅共有的揮發(fā)性成分有20種,空白對照組酒醅中有6種特有成分,為2,3,5-三甲基吡嗪、異丁酸、3-甲硫基丙醇、鄰苯二甲醚、丙二醇、乙偶姻,添加強化曲FBKL 1.0122的酒醅中有1種特有成分,為己酸,添加強化曲FBKL 1.0199的酒醅中有4種特有成分,為苯甲醚、1-乙基環(huán)己醇、5-甲基呋喃醛、乙酸苯乙酯;開窖時酒醅中共有的揮發(fā)性成分有21種,空白對照組酒醅中有3種特有成分,為丁酸乙酯、1-乙基環(huán)己醇、3-甲硫基丙醇,添加強化曲FBKL 1.0122的酒醅中有4種特有成分,為辛酸乙酯、己酸、乙酸苯乙酯、N-甲基-2-吡咯甲醛。

a-空白對照與細菌類強化曲揮發(fā)性成分種類差異;b-空白對照與酵母類強化曲揮發(fā)性成分解類差異圖2 不同發(fā)酵階段揮發(fā)性成分韋恩圖Fig.2 Wayne diagram of volatile components at different fermentation periods

由圖2-b可知,酵母類強化曲在堆積前、堆積后、開窖時揮發(fā)性成分種類分別為39種、35種、32種,在堆積前酒醅種共有的揮發(fā)性成分有18種,空白對照組酒醅中有3種特有成分,為鄰異丙基甲苯、苯甲醚、5-甲基呋喃醛,添加強化曲FBKL 2.00K8的酒醅中有4種特有成分,為2,3,5,6-四甲基吡嗪、己酸、3-甲基噠嗪、3-吡啶甲醇,添加強化曲FBKL 2.0117的酒醅中有3種特有成分,為丁酸乙酯、異丁醇、庚酸乙酯;堆積后酒醅中共有的揮發(fā)性成分有15種,空白對照組酒醅中有5種特有成分,為4-異丙基甲苯、乙偶姻、丙二醇、3-甲硫基丙醇、萜品烯,添加強化曲FBKL 2.00K8的酒醅中有2種特有成分,為5-甲基呋喃醛、己酸,添加強化曲FBKL 2.0117的酒醅中有2種特有成分,為鄰異丙基甲苯、1-乙基環(huán)己醇;開窖時酒醅共有的揮發(fā)性成分有20種,空白對照組酒醅中有2種特有成分,為1-乙基環(huán)己醇、3-吡啶甲醇,添加強化曲FBKL 2.00K8的酒醅中有1種特有成分,為乙偶姻,添加強化曲FBKL 2.0130的酒醅中有2種特有成分,為環(huán)辛四烯、2,3,5,6-四甲基吡嗪。

綜上所述,在發(fā)酵結(jié)束時,空白對照和添加強化曲的實驗組酒醅共有揮發(fā)性成分種類最多,空白對照和細菌類強化曲、酵母類強化曲共有的揮發(fā)性成分分別為21種、20種,添加強化曲FBKL 1.0122、FBKL 2.0130、FBKL 2.00K8的酒醅中的特有成分分別為4、2、1種。

2.3.2 強化曲對酒醅中揮發(fā)性成分含量影響

圖3 不同發(fā)酵階段酒醅中揮發(fā)性成分含量的熱圖Fig.3 The heat map of volatile components in fermented grains at different fermentation periods

通過半定量分析可以發(fā)現(xiàn),在12種酯類物質(zhì)中,以乙酸乙酯為主,苯乙酸乙酯、棕櫚酸乙酯次之。在10種醇類物質(zhì)中,以苯乙醇、糠醇為主,苯乙醇能夠賦予白酒玫瑰花香味[12];糠醇是醬香型白酒焦香和烘焙香的關鍵來源[13]。在6種酸類物質(zhì)中,主要為乙酸,其次是丁酸,乙酸可以烘托緩和白酒的主體香味,丁酸能夠賦予白酒愉悅的水果香味、增強白酒的窖香[14-15]。

對檢測到的微量成分進行熱圖繪制,并進行聚類分析。由圖3可知,堆積發(fā)酵前,揮發(fā)性成分主要有乙酸乙酯、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸、糠醛、苯乙烯、苯甲醛、丁二醇、丁酸、糠醇;堆積發(fā)酵后,乙酸異戊酯、戊酸乙酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯含量降低,乙酸、苯乙烯、苯甲醛、丁二醇、丁酸、糠醇含量增加,揮發(fā)性成分種類明顯增多,這可能與堆積發(fā)酵期間微生物大量繁殖,發(fā)生或正在進行一系列代謝反應消耗、生成各類風味成分有關;入窖發(fā)酵至結(jié)束,揮發(fā)性成分種類達到最多,主要有乙酸乙酯、丁酸乙酯、異丁醇、乙酸異戊酯、正己酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、棕櫚酸乙酯、苯乙醇、芐醇、糠醇、乙酸、丙酸、丁酸、糠醛、苯甲醛、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪。其中,丁酸乙酯、2,3,5-三甲基吡嗪、5-甲基呋喃醛、丁二酸二乙酯在入窖發(fā)酵后,含量才逐漸增加;乙酸糠酯在堆積發(fā)酵后,含量逐漸減少;乙酸乙酯、異丁醇、正己酸乙酯、苯甲醛、丙酸、丁二醇、丁酸、糠醇、棕櫚酸乙酯、苯乙醇、芐醇含量隨著發(fā)酵的進行逐漸增加,發(fā)酵結(jié)束時含量最高。

由圖3可知,開窖時,添加產(chǎn)乙酸乙酯強化曲FBKL 2.00K8的酒醅中乙酸乙酯含量最高,為9.257 μg/g,相對于空白對照的6.177 μg/g,乙酸乙酯含量增長了49.9%。添加產(chǎn)苯乙醇強化曲FBKL 2.0117、FBKL 2.0130的酒醅中苯乙醇含量和空白對照組相差不大,分別為 2.38、2.583、2.623 μg/g。添加產(chǎn)吡嗪類物質(zhì)強化曲FBKL 1.0122、FBKL 1.0199的酒醅中2,3,5-三甲基吡嗪含量分別為0.074、0.075 μg/g,相對于空白組的0.067 μg/g,2,3,5-三甲基吡嗪含量分別提升了11.9%、10.4%,研究表明吡嗪類物質(zhì)由美拉德反應、微生物反應、蛋白質(zhì)和氨基酸加熱分解等途徑產(chǎn)生[16],能夠賦予白酒甜香、果香以及花香[17]

3 總結(jié)

本試驗利用3株酵母菌、2株細菌制備單菌強化曲,進行固態(tài)發(fā)酵實驗并運用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術對不同發(fā)酵階段酒醅中揮發(fā)性成分進行檢測分析,共鑒定出45種揮發(fā)性成分,主要包括：酯類、醇類、醛類、酸類、吡嗪類。揮發(fā)性成分種類差異分析表明,開窖時添加強化曲FBKL 1.0122、FBKL 1.0199的酒醅和空白酒醅共有的揮發(fā)性物質(zhì)有21種,添加強化曲FBKL 2.00K8、FBKL 2.0117、FBKL 2.0130的酒醅和空白酒醅共有的揮發(fā)性物質(zhì)有20種。揮發(fā)性成分含量分析表明,添加強化曲 FBKL 2.00K8使酒醅中乙酸乙酯含量提升了49.9%,優(yōu)于許銀等的36.6%[18];添加強化曲FBKL 1.0122、FBKL 11.0199使酒醅中2,3,5-三甲基吡嗪含量分別增長了11.9%、10.4%。

隨著“健康中國2030”規(guī)劃綱要的實施,綠色、健康已經(jīng)成為未來發(fā)展趨勢,對于醬香型白酒品質(zhì)要求也會提高,從大曲、酒醅中篩選功能微生物制備強化曲以提升醬香型白酒酒質(zhì)具有廣闊的應用前景。本試驗以菌株FBKL 2.00K8、FBKL 1.0122、FBKL 1.0199制備強化曲,并進行固態(tài)發(fā)酵實驗,結(jié)果表明強化曲能夠提升酒醅中揮發(fā)性成分含量,為醬香型白酒酒質(zhì)提升提供理論基礎。