碳源、溫度和pH對產油酵母脂肪酸組成的影響

龔佳,黃其田,史榮超,張夢瑤,劉灑灑,楊曉兵*

1(西北農林科技大學 葡萄酒學院,陜西 楊凌,712100)2(中國科學院大連化學物理研究所生物技術部,遼寧 大連,116023)

脂肪酸是一類重要的化合物,被廣泛應用于食品和化學工業中[1]。在食品行業中,飽和脂肪酸可作為某些發酵飲料中的主要芳香物質、表面活性劑、食品添加劑和增塑劑[2-4];奇數碳脂肪酸及其衍生物可作為合成香精和香料等前體物質[5],還可用作飲食評估中食物攝入的標準生物標志物以及冠心病風險和二型糖尿病風險的指示物[1,6]。

當前,利用動、植物油脂生產脂肪酸面臨原料短缺、生產周期長、價格波動大等諸多風險和挑戰,而微生物油脂因其不與民爭糧爭地,不受氣候、環境和場地等限制,培養周期短,易規模化放大等優勢受到廣泛關注[7]。產油酵母是一類能積累超過自身干重30%油脂的微生物[8-9],在特定的培養條件下能夠超過自身干重的60%[10-12]。此外,產油酵母具有生長速度快、底物利用譜廣、耐受多種木制纖維素水解副產物等優點,被認為是生產油脂的理想細胞工廠[13]。

脂肪酸組成的差異賦予油脂不同的功能與用途,富含油酸、硬脂酸和棕櫚酸等長鏈脂肪酸的脂質可用于可可脂的替代品,而富含單不飽和脂肪酸的脂質適合生產生物柴油[14-15]。調控培養基的成分或改變發酵條件(如碳源、溫度和pH等)能夠改變微生物油脂脂肪酸組成,獲得富含特定脂肪酸的油脂[16-17]。本文分析了圓紅冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)等4株產油酵母油脂的脂肪酸組成;研究了碳源、溫度和pH對圓紅冬孢酵母油脂脂肪酸組成的影響,以期為定向改造產油酵母合成特定脂肪酸提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種

圓紅冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)CGMCC 2.1389、皮狀絲孢酵母(Trichosporoncutaneum)CGMCC 2.571、斯達式油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)CGMCC 2.1560,中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC);彎曲隱球菌(Cryptococcuscurvatus)ATCC 20509,美國菌種保藏中心(ATCC)。

1.1.2 培養基與溶液

YPD種子液培養基(g/L)：蛋白胨20,酵母提取物10,葡萄糖20。固體培養基為YPD液體培養基加15 g/L瓊脂粉。

限氮培養基(g/L)：葡萄糖70,(NH4)2SO40.1,酵母提取物0.75,KH2PO41.0,MgSO4·7H2O 1.5,痕量元素儲液1%(體積分數),pH 6.0。

痕量元素儲液(g/L)：CaCl2·2H2O 4.0,FeSO4·7H2O 0.55,一水合檸檬酸0.52,ZnSO4·7H2O 0.1,MnSO4·H2O 0.076;另外補加濃硫酸100 μL/L。以上培養基均在121 ℃下滅菌15 min。

1.1.3 主要設備

ZQZY-CF8振蕩培養箱,上海知楚儀器有限公司;7890B-7000D三重四級桿氣質聯用儀,安捷倫科技有限公司;V-530紫外可見分光光度計,日本分光公司。

1.2 實驗方法和分析方法

1.2.1 產油酵母的培養和產油發酵

將產油酵母在YPD固體培養基上劃線培養,30 ℃,48 h。挑取單菌落,接種到含有50 mL YPD液體培養基的250 mL搖瓶中,30 ℃,200 r/min發酵48 h獲得種子液。以10%的體積比例將種子液接種到含45 mL限氮培養基的250 mL搖瓶中,30 ℃,200 r/min條件下發酵至培養基中碳源低于2 g/L。

1.2.2 碳源、溫度和pH對圓紅冬孢酵母脂肪酸組成的影響

菌株活化、培養等方法同1.2.1。除考察溫度的試驗組外,發酵轉速和溫度均為200 r/min和30 ℃。培養條件試驗組分別為：(1)碳源為葡萄糖、木糖、蔗糖和甘油,C/N摩爾比(C/N=260)配置氮限制培養基;(2)初始pH分別為4、5、6、7和8,用4 mol/L NaOH溶液調控培養基初始pH;(3)溫度：20、25、30、33和37 ℃。

1.2.3 生物量測定方法

取30 mL發酵液,8 000×g離心5 min;所得菌體用去離子水洗滌2次,于105 ℃烘至恒重,以g/L表示菌體生物量。

1.2.4 碳源的測定方法

利用DionexICS2500離子色譜儀(Dionex公司,CarboPac100保護柱(4 mm×50 mm)、CarboPac100分析柱(4 mm×250 mm)。洗脫條件：30 ℃,流速0.5 mL/min。NaOH濃度從0到15 min為22 mmol/L,隨后1 min內增加到200 mmol/L,保持15 min[18]。甘油、木糖、葡萄糖和蔗糖的保留時間分別為1.7、12.2、13.5和16.7 min。

1.2.5 油脂含量測定方法

采用酸熱法提取產油酵母油脂[10]。向裝有0.5 g干菌體的50 mL圓底離心管中加入3 mL的4 mol/L HCl溶液,78 ℃水浴處理1 h,冷卻后加入3 mL甲醇和3 mL氯仿,漩渦振蕩1 min;8 000×g離心5 min收集氯仿層;加入3 mL氯仿重復萃取,直至氯仿層澄清透明;合并氯仿抽提液,加入等體積1 g/L NaCl溶液,振蕩混勻;8 000×g離心5 min,取下層氯仿層,無水Na2SO4過濾;真空蒸發除去氯仿,105 ℃烘干至恒重。以g/L表示油脂產量,g/(g·DCW)表示油脂含量。

1.2.6 脂肪酸組成分析方法

油脂甲酯化[10]：取200 mg油脂,加入0.5 mL 50 g/L的KOH/CH3OH溶液,轉入10 mL圓底燒瓶,70 ℃回流50 min;加入0.7 mL三氟化硼乙醚甲醇溶液[V(三氟化硼乙醚溶液)∶V(甲醇)=4∶10],繼續回流10 min,冷卻后加入1 mL去離子水并混勻;加入0.7 mL正己烷萃取,去離子水洗滌2次,用0.22 μm濾膜過濾后用GC-MS進行分析。

脂肪酸組成分析：Agilent 7890A-7000D型氣質聯用儀(GC-MS),色譜柱采用HP-5MS(30 m×0.25 m×0.25 μm)。升溫程序：初始溫度80 ℃,保持1 min,7 ℃/min升溫至250 ℃,保持10 min;分流進樣比10∶1;載氣氦氣;流速1.0 mL/min;測定方式：全掃描方式;進樣量1 μL。

1.3 數據處理

試驗結果均以平均值±標準差表示,每個試驗平行3次。采用Origin 2021進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 不同產油酵母的脂肪酸組成分析

營養限制是常用的促進產油微生物合成和積累油脂的策略[18]。本研究采用氮元素限制培養基實現油脂合成積累,采用C/N質量比為260,所得4株產油酵母油脂產量分別為7.5、9.41、8.75和10.6 g/L,含量分別為52.74%、43.8%、42.19%和53.56%(圖1)。

4株菌油脂中有18種共有脂肪酸,包括短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFA,C<10)：己酸(C6∶0)、庚酸(C7∶0)、辛酸(C8∶0)和壬酸(C9∶0);中鏈脂肪酸(medium-chain fatty acid,MCFA,10≤C<16)：葵酸(C10∶0)、月桂酸(C12∶0)、肉豆蔻酸(C14∶0)和十五烷酸(C15∶0);長鏈脂肪酸(long-chain fatty acid,LCFA,16≤C<20)：棕櫚油酸(C16∶1)、棕櫚酸(C16∶0)、十七碳烯酸(C17∶1)、十七烷酸(C17∶0)和油酸(C18∶1),硬脂酸(C18∶0);超長鏈脂肪酸(very long-chain fatty acid,VLCFA,C ≥ 20)：二十烷酸(C20∶0)、二十二烷酸(C22∶0)、二十三烷酸(C23∶0)和二十四烷酸(C24∶0)(圖2-b～2-e)。除皮狀絲孢酵母外,另3株產油酵母油脂中還含有二十五烷酸(C25∶0)和二十六烷酸(C26∶0);亞油酸(C18∶2)僅在圓紅冬孢酵母油脂中出現(圖2-d)。

4株產油酵母油脂中LCFA占總脂肪酸的90%左右,其中C18∶1、C18∶0和C16∶0在圓紅冬孢酵母中含量分別為38.38%、17.71%和35.77%;在皮狀絲孢酵母中為11.73%、11.94%和66.71%;在斯達式油脂酵母中為19.12%、23.54%和43.97%;在彎曲隱球菌中為20.25%、28.51%和40.08%(圖2-a),與之前報道基本一致[19]。產油酵母油脂中SCFA含量為0.57%～2.44%,MCFA含量為0.28%～1.67%,VLCFA含量為5.30%～8.11%,這些脂肪酸總量僅占總脂肪酸的10%左右(圖2-a)。

a-脂肪酸類別;b-SCFA;c-MCFA;d-LCFA;e-VLCFA圖2 四種產油酵母油脂的脂肪酸組成Fig.2 Fatty acid composition of lipids from the four oleaginous yeasts.

2.2 培養條件對圓紅冬孢酵母的脂肪酸組成的影響

2.2.1 碳源對圓紅冬孢酵母的脂肪酸組成的影響

碳源因代謝路徑的不同,其能量和還原度會有細微差別。在合成油脂過程中,碳源不僅影響產油酵母生長、油脂積累和脂肪酸的組成,還會影響油脂的功能和用途[19-20]。圓紅冬孢酵母能夠利用葡萄糖高效合成胞內油脂,油脂中的脂肪酸多達21種,在所試酵母中具有一定代表性。因此,以圓紅冬孢酵母為研究對象,探究碳源、溫度和pH對產油酵母的脂肪酸組成的影響。葡萄糖、木糖、蔗糖和甘油是常用的微生物油脂生產碳源,以該4種碳源為底物時,圓紅冬孢酵母油脂產量為12.16～16.61 g/L,油脂含量為48.6%～54.52%(圖3);所得油脂中分別檢測到了21、20、20和20種脂肪酸,但在后3種碳源為底物所獲的油脂中未檢測到C12∶0(圖4-c)。

在4種所試碳源中,圓紅冬孢酵母油脂中的LCFA含量均占到總脂肪酸的90%以上(圖4-a)。以葡萄糖為碳源時,油脂中C18∶1、C18∶0和C16∶0的含量分別為42.38%、17.71%和30.78%;以木糖為碳源時,其含量為分別為47.45%、11.85%和32.24%;以蔗糖為碳源時,其含量分別為46.54%、12.22%和33.39%;以甘油為碳源時,其含量分別為35.68%、23.79%和29.29%(圖4-d)。在這4種碳源中,SCFA的總含量為0.57%～79%;MCFA的總含量為0.27%～2.21%;VLCFA的總含量為2.86%～5.66%(圖4-a)。總體而言,木糖和蔗糖有利于圓紅冬孢酵母積累C18∶和C16∶0;甘油有利于C17∶0和C18∶0的積累;葡萄糖和甘油則有利于VLCFA的合成與積累。

圖3 碳源對圓紅冬孢酵母的生物量、油脂濃度和油脂含量的影響Fig.3 Effect of carbon source on the biomass,lipid titer,and lipid content of R.toruloides

a-脂肪酸類別;b-SCFA;c-MCFA;d-LCFA;e-VLCFA圖4 碳源對圓紅冬孢酵母的脂肪酸組成和含量的影響Fig.4 Effects of carbon source on the fatty acid composition and content of R.toruloides

2.2.2 溫度對圓紅冬孢酵母的脂肪酸組成的影響

培養溫度能夠影響細胞內酶的活性,擾動細胞內代謝途徑及強度,改變細胞(膜)中飽和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)和不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acids,UFA)的比例[21]。在試驗溫度范圍內,圓紅冬孢酵母中油脂產量為6.57～9.28 g/L,油脂含量49.01%～61.13%,油脂產量和含量均呈現先升高后降低的趨勢,表明低溫或高溫均不利于生物量和油脂積累(圖5)。

如圖6所示,在所試溫度范圍內,油脂中LCFA的含量始終占總脂肪酸的90%以上,其中C18∶1的含量在30.21%～41.70%,C18∶0的含量在14.30%～16.86%,波動不大;C16∶0的含量在35.56%～44.82%。SCFA總含量在0.43%～1.58%;MCFA含量為2.04%～2.64%;VLCFA含量為3.07%～5.86%,近1.9倍的變化。此外,結果還表明培養溫度為20 ℃時有利于C8∶0、C9∶0、C12∶0以及C17系奇數碳脂肪酸的積累,但20 ℃時僅檢測到17種脂肪酸,未檢測到C10∶0、C18∶2、C25∶0和C26∶0;37 ℃有利于C20∶0、C22∶0和C24∶0等VLCFA的積累。

圖5 溫度對圓紅冬孢酵母的生物量、油脂濃度和油脂含量的影響Fig.5 Effect of temperatures on the biomass,lipid titer,and lipid content of R.toruloides

∑C18/∑C16和C18∶1/C18∶0可分別作為延長酶和Δ9去飽和酶活性的參數[22]。調控溫度能夠改變油脂中SFA與UFA的比例。當溫度較低時,∑C18/∑C16和值都比較低,提示延長酶和Δ9去飽和酶活性較低,影響了相應脂肪酸的合成。

a-脂肪酸類別;b-SCFA;c-MCFA;d-LCFA;e-VLCFA圖6 溫度對圓紅冬孢酵母的脂肪酸組成和含量的影響Fig.6 Effect of temperature on the fatty acid composition and content of R.toruloides

2.2.3 pH對圓紅冬孢酵母的脂肪酸組成的影響

培養基pH能夠改變蛋白質等生物大分子所帶電荷,引起細胞膜電荷變化,從而改變微生物吸收利用營養物質的能力[23]。培養基中初始pH為4～8時,圓紅冬孢酵母中油脂產量為77.06～9.16 g/L,油脂含量為48.41%～58.90%(圖7)。

如圖8所示,C18∶1含量為40.03%～43.60%,C18∶0含量為11.23%～13.63%,C16∶0含量為32.95%～36.16%,表明初始pH值對C16∶0、C18∶0和C18∶1的含量影響較小。在pH為7和8時,C16∶1含量是其他pH時1.5倍左右。在pH為5時有利于C18∶2的積累。pH在4～8,SCFA含量為0.32%～0.63%,MCFA的含量為2.10%～2.26%,VLCFA的含量為2.59%～3.35%。當pH為5時,SCFA含量降至最低;pH為4時,C22∶0的含量最高。

圖7 初始pH對圓紅冬孢酵母的生物量、油脂濃度和油脂含量Fig.7 Effect of initial pH on the biomass,lipid concentration,and lipid content of R.toruloides

a-脂肪酸類別;b-SCFA;c-MCFA;d-LCFA;e-VLCFA圖8 初始pH對圓紅冬孢酵母的脂肪酸組成和含量的影響Fig.8 Effect of initial pH on the fatty acid composition and content of R.toruloides

3 結論

本文解析了圓紅冬孢酵母、皮狀絲孢酵母、斯達式油脂酵母和彎曲隱球酵母的油脂脂肪酸組成,證明產油酵母能夠合成和積累鏈長介于6～26的多種脂肪酸。通過調控培養條件,能夠改變產油酵母油脂中脂肪酸的組成。碳源和溫度對油脂脂肪酸組成的影響較大,主要影響C16和C18系脂肪酸、SCFA和VLCFA在油脂中組成比例,而初始pH則會影響油脂產量和含量。本研究豐富了產油酵母脂肪酸組成的相關信息,為后續構建脂質細胞工廠合成特定脂肪酸及衍生物提供了依據。