營養脅迫對糞腸球菌Gr17細菌素合成的調控

段嬌嬌,聶蓉,劉國榮,王昭,朱澤康

(北京食品營養與人類健康高精尖創新中心 北京市食品添加劑工程技術研究中心 北京工商大學,北京,100048)

細菌素是一種由細菌核糖體分泌的對近源微生物具有抑制作用的蛋白質或多肽類物質,具有安全性高,易被人體消化吸收等優點,可作為天然食品防腐劑用于食品生產中[1]。乳酸菌細菌素由于具有良好的耐熱性、廣譜抑菌活性等優點而成為研究熱點[2]。實驗室前期從白酒酒醅中分離出1株高產細菌素的糞腸球菌Gr17(EnterococcusfaecalisGr17),其所產細菌素屬于Ⅱa類乳酸菌細菌素,能夠抑制多種食品腐敗菌和食源性致病菌[3]。但菌株在自然環境和食品生產中常常會面臨多種環境脅迫,如酸脅迫[4]、滲透壓脅迫[5]、高壓脅迫[6]、冷脅迫[7]等。細菌的生長繁殖和代謝活動均依賴于營養物質,營養脅迫下細菌代謝活動產生變化,影響菌體生長及細菌素合成。馬佳歌等[8]研究表明在缺乏葡萄糖的條件下LactiplantibacillusplantarumKLDS 1.0328的生長和細菌素抑菌活性均受到抑制。KUMAR等[9]發現碳源脅迫(1/2葡萄糖)和氮源脅迫(1/2蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉)對PediococcuspentosaceusNKSM1的生長與細菌素合成均有不利影響。VERLUYTEN等[10]研究表明復合營養脅迫(1/2 MRS)抑制LactobacilluscurvatusLTH 1174生長,但可促進細菌素合成。由于菌株本身的特異性,不同脅迫條件對菌體生長及細菌素合成調控作用不同。

群體感應(quorum sensing,QS)是細菌的一種調節機制,細胞通過隨菌體密度波動的特定信號分子誘導特定基因表達,從而實現對生物膜形成、胞外多糖形成、細菌素合成等一系列微生物行為的調控[11-13]。QS是乳酸菌細菌素合成的關鍵調控機制,目前普遍認為與乳酸菌細菌素合成相關的QS調控系統由自誘導肽(autoinducing peptides,AIPs)和雙組份信號轉導系統(two component system,TCS)組成[14]。TCS包括組氨酸蛋白激酶(histidine protein kinase,HPK)和感應調節蛋白(response regulator protein,RR)。AIPs隨菌體密度增大而增加,當達到一定閾值后,激活細胞膜上的HPK,使其發生自我磷酸化。磷酸基團轉移至RR信號輸出區域的保守天冬氨酸殘基位點,使其發生磷酸化。磷酸化的RR與目的基因特定位點結合,激活細菌素基因表達。已有研究表明營養脅迫可以對乳酸菌QS系統產生影響[15-16]。由此QS系統可能在營養脅迫調控細菌素的合成中起重要作用。但目前關于營養脅迫如何通過QS系統調控細菌素合成少有研究報道。

基于上述原因,本研究以糞腸球菌Gr17為研究對象,測定了營養脅迫對其生長及細菌素活性的影響,篩選可正向調控細菌素合成的營養脅迫條件,并初步探究這一正向調控的具體機制,以期為營養脅迫對細菌素合成的調控相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腸球菌Gr17,由本實驗室保存于-80 ℃;大腸桿菌(Escherichiacoli)1.90,中國普通微生物菌種保藏管理中心;NaOH、NaCl,天津大茂化學試劑廠;TSB培養基、TSA培養基、MRS肉湯培養基,杭州百思生物;細菌總RNA提取試劑盒、FastKing一步法反轉錄-熒光定量試劑盒(FP314)、SuperReal彩色熒光定量預混試劑(SYBR Green),天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

TG-16G離心機,常州隆和儀器制造有限公司;TG600酶標儀,云鉑儀器有限公司;FastDry-1真空離心濃縮儀,北京博醫康實驗儀器有限公司;HJ-6AB多頭磁力攪拌器,金壇市華城潤華實驗儀器廠;HZQ-F400全溫振蕩培養箱,常州普天儀器制造有限公司;CFX96 Real-Time System、C1000 Touch PCR儀,美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種的活化

將甘油管中的糞腸球菌Gr17以1%接種量接種于已滅菌的MRS液體培養基中,37 ℃培養18 h,連續活化2代后用于實驗。

1.3.2 營養脅迫處理菌株

用9 g/L的生理鹽水稀釋MRS培養基(營養物質濃度48.3 g/L),得1/4 MRS、1/2 MRS和3/4 MRS,質量濃度分別為12.075、24.15、36.225 g/L。將活化后的Gr17以1%的接種量接種于不同濃度的培養基中,37 ℃靜置培養28 h。

1.3.3 菌體生長測定

取1.3.2所得發酵液200 μL加入96孔板中,用酶標儀測定其OD600 nm。

1.3.4 抑菌活性的測定

取1.3.2所得發酵液,8 000 r/min離心10 min,用0.1 mol/L的NaOH溶液將上清液pH調至7.0,采用真空離心濃縮儀濃縮25倍,得細菌素粗提液。按參考文獻[17-18]采用瓊脂擴散法測定粗提液抑菌活性,以大腸桿菌1.90為指示菌。

1.3.5 正常條件與最佳脅迫條件下細菌生長性能比較

按1%接種量將Gr17分別接種于MRS和1/4 MRS液體培養基中,37 ℃培養40 h,每隔4 h取樣,按1.3.3與1.3.4中方法測定樣品菌體生長情況及抑菌活性。

1.3.6 正常條件與最佳脅迫條件下部分基因表達的比較

由實驗室對Gr17進行的全基因組測序結果,該菌具有10個與細菌素合成有關的基因,entI、entJ和entGr17編碼細菌素結構蛋白,分別編碼細菌素enterocin L50A、enterocin L50B,enterocin Gr17;AS-48E、AS-48F、AS-48G、AS-48H共同編碼ABC(ATP-Binding Cassette)轉運系統的ABC轉運蛋白及其輔助蛋白;hpk和rr分別編碼TCS中的HPK和RR;AIP編碼自誘導肽。在此基礎上進一步研究這10個基因在最佳營養脅迫條件下表達量的變化。

1.3.6.1 總RNA提取及逆轉錄

按1%接種量將Gr17分別接種于MRS和1/4 MRS液體培養基中,37 ℃培養48 h,每隔6 h取樣,按天根細菌總RNA提取試劑盒(DP430)說明書提取總RNA,將提取的RNA在冰浴上按FastKing一步法反轉錄-熒光定量試劑盒(FP314)說明書混合體系并合成cDNA。

1.3.6.2 RT-qPCR引物設計

采用Primer Premier 5.0軟件設計RT-qPCR引物,設計結果如表1。

表1 RT-qPCR引物Table 1 RT-qPCR primers

續表1

1.3.6.3 RT-qPCR擴增實驗

以16S rRNA為內參基因[19],按SuperReal彩色熒光定量預混試劑試劑盒說明書配制反應體系,具體見表2,RT-qPCR參數如表3。記錄數據并分析得到的Ct值,以2-ΔΔCt相對定量法分析目的基因表達量的變化。按公式(1)計算：

F=2-ΔΔCt=

2-(Ct目的基因-Ct內參基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct內參基因)對照組

(1)

表2 RT-qPCR反應體系Table 2 RT-qPCR reaction system

表3 RT-qPCR參數Table 3 RT-qPCR parameters

1.4 數據分析

結果均為3 次獨立重復實驗數據的平均值,采用Origin 8.5進行數據分析和作圖,并利用SPSS 17.0進行方差分析。P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 營養脅迫對Gr17的生長及細菌素合成的影響

由圖1可知,相同條件下培養28 h后,對照組Gr17的菌體密度最大,處理組菌體密度隨培養基初始營養物質濃度降低逐漸減小,表明營養脅迫條件抑制菌體生長。1/2 MRS和3/4 MRS的脅迫條件下細菌素抑菌活性均低于對照組且變化趨勢與菌體密度一致。但菌株在1/4 MRS中所產細菌素抑菌活性最大(效價704 AU/mL),較對照組增加80 AU/mL?；谏鲜鼋Y果,選擇1/4 MRS作為最佳脅迫條件進行后續研究。

圖1 營養物質濃度對腸球菌Gr17生長和細菌素合成的影響Fig.1 Effects of nutrient concentrations on the growth and bacteriocin synthesis of E.faecalis Gr17

2.2 可正向調控細菌素合成的最佳脅迫條件對Gr17的生長及細菌素合成的影響

測定不同時間下MRS和1/4 MRS中的菌體密度和細菌素抑菌活性(圖2),結果表明脅迫處理的菌株生長至24 h開始進入穩定期,較對照組延遲4 h,OD600 nm值也顯著降低(P<0.05),最大OD600 nm僅為0.725,較對照組最大OD600 nm(0.883)顯著降低(P<0.05)(圖2-a)。表明1/4 MRS的脅迫條件會抑制Gr17生長。

a-生長情況;b-細菌素抑菌活性圖2 正常條件與營養脅迫下腸球菌Gr17生長情況與細菌素抑菌活性Fig.2 Growth and bacteriocin activity of E.faecalis Gr17 under normal and nutritional stress condition

由圖2-b可知,在MRS中,菌株自8 h開始合成細菌素,28 h細菌素抑菌活性達到最高(640 AU/mL),此后細菌素產量隨菌體密度減小逐漸下降。1/4 MRS中,菌株自12 h開始合成細菌素,較對照組延后4 h,原因為當菌體細胞達到一定密度,AIPs積累至一定閾值激活QS,細菌素才開始合成,營養脅迫下菌株生長狀況差,從而菌體密度達到細菌素開始合成的閾值的時間延長(圖2-b)。自20 h,同一時間脅迫條件下的細菌素抑菌活性更強,且其在36 h時達到的最大抑菌活性(720 AU/mL)顯著高于對照組的最大抑菌活性(640 AU/mL)(P<0.05),表明1/4 MRS這一脅迫條件可促進細菌素的合成分泌(圖2-b)。

2.3 可正向調控細菌素合成的最佳脅迫條件對Gr17細菌素合成相關基因表達的影響

2.3.1 編碼自誘導肽相關基因的表達

基因AIP在MRS和1/4 MRS下的表達量如圖3所示,兩種條件下AIP的表達趨勢均與菌體密度的變化趨勢基本一致。12 h前,營養脅迫下菌體密度較對照組減小(圖2-a),AIPs積累量較低,這與圖3營養脅迫條件下AIP的表達量低于對照組結果一致。自18 h,1/4 MRS中AIP的表達量卻較對照組顯著上調(P<0.05),表明1/4 MRS下AIP的表達受到正向調控。

a-6 h;b-12 h;c-18 h;d-24 h;e-36 h;f-48 h圖3 正常條件與營養脅迫下基因hpk、rr、AIP表達量變化Fig.3 Changes in the expression of genes hpk,rr and AIP under normal and nutritional stress conditions

2.3.2 編碼雙組分系統中組氨酸蛋白激酶和感應調節蛋白基因的表達

如圖3所示,hpk與rr的表達量變化趨勢與AIP的趨勢基本一致。6～12 h,與對照組相比,營養脅迫條件下hpk和rr表達量較低,這可能是因為營養脅迫影響菌體生長,導致AIPs積累量低,hpk和rr未被大量激活。18 h起,AIP表達量上調,AIPs合成量增加,hpk與rr被大量激活,表達量顯著上調(P<0.05)。表明1/4 MRS這一脅迫條件可能通過影響AIP正向調控hpk與rr的表達。

2.3.3 編碼細菌素相關基因的表達

entI、entJ和entGr17在MRS和1/4 MRS中的表達量如圖4,兩種條件下entI、entJ和entGr17的表達趨勢與細菌素產量的趨勢基本一致。6～12 h,營養脅迫條件下entI、entJ和entGr17的表達量低于正常培養條件;但自18 h,營養脅迫條件下entI、entJ和entGr17的表達量較對照組均出現顯著上調(P<0.05)。這一結果與2.3.1和2.3.2中結論相符,推測1/4 MRS這一營養脅迫條件通過上調AIP的表達,進而上調hpk、rr的表達,最終實現對細菌素結構基因的調控。

2.3.4 編碼ABC轉運系統的ABC轉運蛋白及其輔助蛋白相關基因的表達

AS-48E、AS-48F、AS-48G、AS-48H在MRS和1/4 MRS下的表達量如圖5所示,兩種條件下這4個基因的表達均與細菌素產量的趨勢基本一致。6 h之前,QS系統尚未啟動,細菌素未開始合成,僅有少量AIPs需借助ABC轉運系統運送至胞外,而脅迫條件下AIPs積累量較低,故AS-48E、AS-48F、AS-48G、AS-48H的表達量低于對照組。12～18 h,菌體密度已達到啟動QS系統的閾值,這4個基因的表達量上調,以合成足量ABC轉運蛋白參與AIPs及細菌素的轉運,但此時僅有少量AIPs及細菌素需要運輸,故上調不明顯。18 h后,大量AIPs及細菌素被生產出來,對ABC轉運蛋白需求量增大,這4個基因的表達量較對照組顯著上調(P<0.05)。36 h左右,菌體生長到達后期,AIPs減少,細菌素合成量降低,對ABC轉運蛋白需求量減小,AS-48E、AS-48F、AS-48G、AS-48H的表達量相應下調。但營養脅迫條件下AS-48E、AS-48F、AS-48G和AS-48H的表達量仍高于對照組。表明1/4 MRS可間接上調ABC轉運系統相關基因表達量(P<0.05)。

a-6 h;b-12 h;c-18 h;d-24 h;e-36 h;f-48 h圖4 正常條件與營養脅迫下基因ent I、ent J和ent Gr17表達量變化Fig.4 Changes in the expression of genes ent I,ent J and ent Gr17 under normal and nutritional stress conditions

a-6 h;b-12 h;c-18 h;d-24 h;e-36 h;f-48 h圖5 正常條件與營養脅迫下ABC轉運系統相關基因表達量變化Fig.5 Changes in the expression of genes related to ABC transport system under normal and nutritional stress conditions

3 結論與討論

本研究表明,營養脅迫抑制糞腸球菌Gr17的生長,MATARAGAS等[20]研究表明氮源脅迫可對L.curvatusL442產生生長抑制;PARLINDUNGAN等[21]發現L.plantarumB21受到葡萄糖脅迫時,細胞活力和生長速度明顯降低;LEROY等[22]也發現糖和復合營養素(蛋白胨、肉膏、酵母提取物)脅迫下,E.faeciumRZS C5細胞生長下降,最大生物量減小,與本文研究結果相似。

關于營養脅迫對乳酸菌細菌素合成的影響,有研究表明[21]葡萄糖脅迫對L.plantarumB21細菌素的合成無明顯影響;LEROY等[22]也發現在培養基葡萄糖質量濃度為2.5、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、80.0 g/L以及1/4、1/2復合氮源(蛋白胨、肉膏、酵母提取物)脅迫條件下,屎腸球菌RZS C5的細菌素產量無明顯變化。但葡萄糖及蛋白胨、酵母抽提物等氮源脅迫條件抑制細菌素的合成[8-9]。然而,KIM等[23]發現與總營養物質濃度較高時相比,營養濃度較低時Lactococcuslactissubsp.lactisC2SmPrt-細菌素產量較高;LEROY等[24]測定了不同復合氮源(牛肉粉、蛋白胨、酵母提取物)濃度下LactobacillussakeiCTC 494的細菌素活性,結果表明低氮源濃度下細菌素活性更高。CALLEWAERT等[25]發現MRS中復合氮源(牛肉浸粉、蛋白胨、酵母提取物)增加,LactobacillusamylovorusDCE 471的特異性細菌素產量降低;VERLUYTEN等[10]發現L.curvatusLTH 1174在1/2 MRS中的細菌素產量較MRS中增加。不同研究中所得結論的差異可能與菌株本身特性和具體脅迫條件有關。目前很多研究通過富營養條件或調整培養基營養物質成分及配比提高細菌素產量[26-28],但成本高且增產效果有限。本研究發現1/4 MRS下Gr17的細菌素活性顯著提高,表明適當的營養脅迫條件可以正向調控細菌素合成。這是因為細菌在自然環境下面臨多種競爭,細菌通過合成細菌素抑制其他細菌的生長以達到自我保護的目的。營養豐富時,細菌缺少競爭壓力,細菌素的合成分泌下降。但脅迫條件使細菌素生產機制處于活躍狀態,細菌素產量由此增大。

對于營養脅迫調控細菌素合成的機制目前無明確定論,基于本文研究結果,推測1/4 MRS營養脅迫條件正向調控細菌素合成的機制為：營養脅迫促使編碼AIPs的基因AIP上調,AIPs合成量增大。AIPs積累達閾值后,激活HPK,HPK發生自磷酸化,接著激活RR,RR靶向激活細菌素結構基因entI、entJ和entGr17,細菌素合成量增大。因為AIPs和已合成的細菌素需借助ABC轉運系統運送至胞外,故編碼ABC轉運系統的基因表達量也發生上調,具體見圖6。

圖6 營養脅迫正向調控細菌素合成機制預測圖Fig.6 Prediction of the mechanism of nutrient stress positively regulating bacteriocin synthesis

本研究結果表明營養脅迫可以通過種內QS系統調控細菌素合成。目前有研究表明fsrQS系統在糞腸球菌合成抗菌肽的過程中具有調控作用,該系統通過fsrABCD4個基因調控編碼重要蛋白酶和抗菌蛋白的靶位點fsrBCD,gelE-sprEoperons,ef1097,進而影響抗菌肽的合成[29-30]。還有研究表明由信號分子AI-2介導的LuxS種間QS系統可能參與饑餓環境下乳酸菌的應激反應,YEO等[16]發現乳桿菌在饑餓脅迫下,QS系統中的AI-2活性升高。GU等[15]研究稀釋的MRS中AI-2活性顯著高于對照組,且QS相關基因LuxS過表達。營養脅迫下還可能存在其他細菌素合成調控機制,隨著相關研究的深入,營養脅迫有望成為一種有效提高細菌素產量的方法。