NDRG1 mRNA在結直腸癌中的表達及意義

歐陽清，康海仙，姚運紅，何平，陳新，曾尚明，梁艷芳

1.廣東東莞市東城醫院病理科,廣東 東莞 523000；2.廣東醫科大學基礎學院生物技術系,廣東 東莞 523808；3.廣東醫科大學基礎學院病理學系，廣東 東莞 523808；4.廣東東莞市東城醫院普外科,廣東 東莞 523000；5.廣東東莞市濱海灣中心醫院病理科，廣東 東莞 523905

結直腸癌是人類常見的消化系統惡性腫瘤，在我國惡性腫瘤死因順位排名中居于第三位[1]，結直腸癌的高危因素包括：吸煙、酒精、紅肉及加工肉的攝入、家族史等[2]，但其確切的發病機制尚不明確，目前普遍認為結直腸癌發生過程是一個多基因變異、多階段、多步驟的過程，是癌基因突變激活或抑癌基因失活，逐漸改變基因的結果[3]，因此研究癌基因的激活及抑癌基因的失活具有重要意義。分化相關基因NDRG1在多種惡性腫瘤中具有促進或抑制的重要作用，目前有關NDRG1 mRNA與結直腸癌的發生及臨床病理特征的關系的研究報道不多，且存在分歧[4-5]，該研究選取東莞市東城醫院及東莞市濱海灣中心醫院進行結直腸腺癌根治術的72例患者為研究對象，探討NDRG1 mRNA在結直腸癌中的表達及意義。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集東莞市東城醫院及東莞市濱海灣中心醫院進行結直腸腺癌根治術72例患者，對結直腸癌組織及其配對的癌旁組織進行取樣?；颊吣挲g32～76歲，中位年齡60歲；男45例，女27例。所有患者分期按照WHO《消化系統腫瘤病理學和遺傳學》進行組織學分型、TNM分期及計算腫瘤浸潤深度。組織學分型：高分化16例，中分化41例，低分化15例；TNM分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期21例,Ⅲ期24例，Ⅳ期11例；淋巴結轉移者30例，無轉移為42例。所有患者術前均未進行放、化療。術后所有的標本離體后即取樣，剪成適量大小置于液氮中保存備用。

1.2 試劑與儀器

Trizol試劑、RT-PCR試劑盒、DNA marker均為TaKaRa大連公司產品；人NDRG1和β-actin引物由上海生工公司合成；PCR儀和ChemiDoxXRS凝膠成像系統購于美國Bio-RAD公司。

1.3 方法

RNA提取及cDNA合成按照說明書進行。NDRG1基因上游引物：5＇-CCGGCGCGACCTGGAG ATTGAG-3＇下游引物：5＇-TGTTCCCAGCAGCACCCGAGTTG-3＇、β-actin內參基因上游引物：5-CTTTCAGA ATCAGGGAACAAT-3＇下游引物：5＇-CGTAGAGATGAGAGTTTCAC ACA-3＇,以cDNA為模板，嚴格按照RT-PCR試劑盒操作說明書進行PCR反應。PCR反應條件：95℃預變性1.5 min；94℃變性10 s，56℃退火40 s，72℃延伸15 s，循環35次，最后72℃延伸10 min。產物經2.5%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像系統進行拍照，采用Image J軟件分析NDRG1基因電泳條帶吸光度值，計算NDRG1 mRNA的相對表達量。

1.4 統計方法

采用SPSS 17.0統計學軟件處理數據，符合正態分布的計量資料用（±s）表示，采用t和F檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NDRG1 mRNA在結直腸癌、癌旁結直腸黏膜組織中的表達情況

NDRG1 mRNA在結直腸癌組織中的相對表達量顯著低于癌旁結直腸黏膜組織，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 NDRG1 mRNA在不同結直腸組織中的相對表達量（±s)Table 1 Relative expression of NDRG1 mRNA in different colorectaltissues（±s)

表1 NDRG1 mRNA在不同結直腸組織中的相對表達量（±s)Table 1 Relative expression of NDRG1 mRNA in different colorectaltissues（±s)

組織類型NDRG1 mRNA相對表達量癌旁結直腸黏膜組織（n=72）結直腸腺癌（n=72）t值P值19.922±15.820 8.683±12.467 24.500<0.001

2.2 NDRG1 mRNA在結直腸癌中表達與臨床病理特征的關系

淋巴結轉移患者癌組織NDRG1 mRNA相對表達量顯著低于未發生淋巴結轉移患者的癌組織；與TNM分期相關（P＜0.05），進一步應用LSD法進行兩兩比較，Ⅰ期的NDRG1 mRNA相對表達量高于Ⅲ期，差異有統計學意義（P＜0.05）；Ⅱ期的NDRG1 mRNA相對表達量高于Ⅲ期，差異有統計學意義（P＜0.05）；其余兩兩比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結直腸癌組織中NDRG1 mRNA與患者的年齡、性別、組織學分型、浸潤深度及腫瘤大小無相關性（P>0.05），見表2。

表2 NDRG1 mRNA在結直腸癌中表達與臨床病理特征的關系[（±s)，×10-2]Table 2 Relationship between NDRG1 mRNAexpression in colorectalcancer and clinicopathologicalcharacteristics[（±s)，×10-2]

表2 NDRG1 mRNA在結直腸癌中表達與臨床病理特征的關系[（±s)，×10-2]Table 2 Relationship between NDRG1 mRNAexpression in colorectalcancer and clinicopathologicalcharacteristics[（±s)，×10-2]

注：△進一步應用LSD法進行兩兩比較，Ⅰ期和Ⅲ期比較，P＜0.05；Ⅱ期Ⅲ期比較，P＜0.05;其余兩兩比較均，P＞0.05

指標 NDRG1mRNA相對表達量 t/F值 P值年齡（歲）≤60（n=37）>60（n=35）性別男（n=45）女（n=27）腫瘤大小（cm）≤4.5（n=41）>4.5（n=31）組織學分型高分化（n=16）中分化（n=41）低分化（n=15）TNM分期Ⅰ期△（n=16）Ⅱ期△（n=21）Ⅲ期△（n=24）Ⅳ期△（n=11）浸潤深度（pT）T1、T2（n=23）T3、T4（n=49）淋巴結轉移無（n=42）有（n=30）7.878±11.619 9.534±13.424 0.314 0.577 8.578±12.733 8.747±12.450 0.003 0.956 9.422±12.961 7.706±11.923 0.331 0.567 8.931±12.731 7.946±12.053 10.433±13.951 0.218 0.805 12.644±13.931 12.681±14.863 3.158±3.490 7.345±14.45 3.130 0.031 10.248±12.317 7.949±12.596 0.529 0.470 11.648±13.755 4.533±9.083 6.108 0.016

3 討論

分化相關基因NDRG1是NDRG家族的第一個成員，1992年在N-myc全身性敲除的小鼠胚胎組織中發現的一個高表達的基因，因而得其名為NDRG1[6]，NDRG1蛋白主要在人的上皮細胞中表達，參與細胞生長、分化、胚胎發生、發育、應激、免疫反應等多種生物學功能[7]。NDRG1在惡性腫瘤中起抑癌或促癌作用，NDRG1抑制多種惡性腫瘤如前列腺癌、鼻咽癌、神經膠質瘤、胰腺癌增殖、侵襲及轉移[8-12]，NDRG1的表達與胃癌細胞分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期呈負相關[13]。相反的研究結果是NDRG1促進膀胱癌增殖、侵襲，促進膀胱癌、食管鱗狀細胞癌的上皮-間質轉化[14-15]。NDRG1促進非小細胞肺癌中腫瘤干細胞樣特性[16]。

有的研究者通過免疫組化方法對非腫瘤結腸組織、結直腸癌根治標本的癌組織、結直腸癌轉移組織（包括淋巴結、肝和膀胱轉移）進行研究，發現NDRG1在結直腸癌樣本中表達較低，相對表達量為（8.984±10.873），NDRG1表達降低與淋巴結、肝、膀胱等轉移顯著相關[4,17]。NDRG1的過表達抑制結直腸癌細胞細胞活力，遷移，侵襲和誘導結腸癌細胞凋亡[6]，抑制結直腸癌上皮-間質轉化，其機制為激活Wnt/βcatenin信號通路、促進caveolin-1泛素化、減弱NF-κB信號[17-18]。由該文研究結果可知，NDRG1 mRNA在結直腸癌組織中的相對表達量（8.683±12.467）顯著低于癌旁直腸黏膜組織（19.922±15.820）(P＜0.05)。與以上研究結果相近。表明NDRG1mRNA在結直腸癌中起抑癌的作用。

該研究采取RT-PCR技術檢測患者癌組織和癌旁組織NDRG1 mRNA的表達情況，結果顯示結直腸癌組織中NDRG1 mRNA相對表達量與TNM分期、和淋巴結轉移相關，淋巴結轉移患者癌組織NDRG1 mRNA相對表達量顯著低于未發生淋巴結轉移患者的癌組織，Ⅰ期的NDRG1 mRNA相對表達量高于Ⅲ期，Ⅱ期的NDRG1 mRNA相對表達量高于Ⅲ期。結直腸癌組織NDRG1 mRNA表達與患者的年齡、性別、癌組織分化程度、浸潤深度及腫瘤大小無關。

綜上所述，對于NDRG1在結直腸癌中的作用目前存在兩種截然相反的觀點，究其原因可能與研究過程中臨床標本選擇、患者因素及檢測手段等密切相關。尚需要更多的研究去論證。