非小細胞肺癌患者外周血自然殺傷細胞受體表達及與腫瘤標(biāo)志物的關(guān)系研究

張靖悅，鄭光輝，楊常建，閆建強

平煤神馬醫(yī)療集團總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 平頂山 467000

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常見的肺癌類型，約占肺癌總數(shù)的80%，由于NSCLC的早期癥狀不明顯，許多患者在就診時已發(fā)展到中晚期，導(dǎo)致預(yù)后極差，病死率高[1]，故早期診斷和積極治療是NSCLC防治的關(guān)鍵。正常生理狀態(tài)下免疫系統(tǒng)能夠清除突變細胞，而NSCLC的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細胞逃避機體免疫監(jiān)視密切相關(guān)[2]。自然殺傷（natural killer，NK）細胞是機體重要的免疫細胞，可直接殺傷腫瘤細胞，其細胞表面包括可激發(fā)NK細胞產(chǎn)生殺傷作用的活化性受體[自然殺傷細胞2族成員D（natural killer group 2 member D，NKG2D）、自然殺傷細胞活化性受體p30（natural killer p30，NKp30）、自然殺傷細胞活化性受體 p44（natural killer p44，NKp44）等]和抑制NK細胞殺傷作用的抑制性受體[自然殺傷細胞2族 成 員 A（natural killer group 2 member A，NKG2A）、CD158a、CD158b][3-4]。腫瘤細胞可通過抑制活化性受體的表達及促進抑制性受體的表達，而削弱NK細胞對腫瘤細胞的免疫監(jiān)視及清除作用[5-6]。腫瘤標(biāo)志物是腫瘤輔助診斷的新突破，對NSCLC的早期診斷有一定價值[7-8]。因此，本研究擬分析NSCLC患者外周血NK細胞受體的表達及與腫瘤標(biāo)志物的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2020年12月平煤神馬醫(yī)療集團總醫(yī)院收治的NSCLC患者的病歷資料。納入標(biāo)準：均經(jīng)病理檢查診斷為NSCLC；首次發(fā)病；未接受過放化療等抗腫瘤治療。排除標(biāo)準：合并急性感染性疾病；既往有腫瘤病史。根據(jù)納入、排除標(biāo)準，共納入122例NSCLC患者作為NSCLC組，其中，男性73例，女性49例；年齡36～85歲，平均（59.68±11.24）歲；病理類型：腺癌62例，鱗狀細胞癌41例，大細胞癌19例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期47例，Ⅲ～Ⅳ期75例。另選取同期在平煤神馬醫(yī)療集團總醫(yī)院體檢的46例健康體檢者作為對照組，其中男性29例，女性17例；年齡32～81歲，平均（61.34±9.46）歲。兩組研究對象性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 樣本采集采集兩組研究對象空腹外周靜脈血各兩管，每管采集5 ml，其中一管用于外周血NK細胞受體表達檢測，需于采集后2 h內(nèi)檢測，另一管用于血清腫瘤標(biāo)志物水平檢測，待離心分離血清后，可于-80℃冰箱保存待測。

1.2.2 外周血NK細胞受體表達檢測每個流式管中加入50 μl全血，再加入5 μl anti-CD3-FITC、anti-CD56-APC、anti-CD16-Per CP，然后每管再分別加入5 μl單克隆抗體（anti-NKG2D-PE、anti-NKp30-PE、anti-NKp44-PE、anti-NKG2A-PE、anti-CD158a-PE、anti-CD158b-PE），同時設(shè)置陰性對照組，加入相同熒光標(biāo)記的同種免疫球蛋白。各組樣本經(jīng)充分混勻后，在室溫下放置20 min，再加入細胞裂解液室溫靜置10 min，再加入磷酸鹽緩沖液振蕩混勻，再用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，然后使用流式細胞儀進行上機檢測。

1.2.3 血清腫瘤標(biāo)志物水平檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測兩組研究對象血清腫瘤標(biāo)志物[癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、細胞角質(zhì)蛋白19片段抗原21-1（cyto-keratin 19 fragment antigen 21-1，CYFRA21-1）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）]水平，試劑盒均購自瑞士羅氏公司，實驗操作步驟按照試劑盒說明書進行操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗，計數(shù)資料以例數(shù)表示，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血NK細胞受體表達水平的比較

NSCLC組患者NK細胞活化性受體NKG2D、NKp30、NKp44表達水平均明顯低于對照組，抑制性受體NKG2A、CD158a、CD158b表達水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 兩組研究對象外周血NK細胞受體表達水平的比較（%，x-± s）

2.2 不同病理類型及TNM分期NSCLC患者外周血NK細胞受體表達水平的比較

不同病理類型的NSCLC患者外周血NK細胞受體表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者NK細胞活化性受體NKG2D、NKp30、NKp44表達水平均明顯低于Ⅰ～Ⅱ期患者，抑制性受體NKG2A、CD158a、CD158b表達水平均明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=11.205、4.725、3.002、7.162、5.287、8.112，P＜0.01）。（表2）

表2 不同病理類型及TNM分期NSCLC患者外周血NK細胞受體表達水平（%，x-± s）

2.3 血清腫瘤標(biāo)志物水平的比較

NSCLC組患者血清腫瘤標(biāo)志物CEA、CYFRA21-1、NSE水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表3）

表3 兩組研究對象血清腫瘤標(biāo)志物水平的比較（ng/ml，±s）

表3 兩組研究對象血清腫瘤標(biāo)志物水平的比較（ng/ml，±s）

組別NSCLC組（n=122）對照組（n=46）t值CEA 37.36±3.83 1.47±0.52 63.220 CYFRA21-1 10.95±2.62 1.92±0.50 23.176 NSE 17.06±1.99 7.65±2.42 25.712 P值0.0000.0000.000

2.4 NSCLC患者外周血NK細胞受體表達與腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析顯示，NSCLC患者活化性受 體 NKG2D、NKp30、NKp44及抑制性受體CD158a、CD158b表達與腫瘤標(biāo)志物CEA、CYFRA21-1、NSE水平均無相關(guān)性（P＞0.05）；NSCLC患者抑制性受體NKG2A表達與CEA水平呈正相關(guān)（P＜0.05），與CYFRA21-1、NSE均無相關(guān)性（P＞0.05）。（表4）

表4 NSCLC患者外周血NK細胞受體表達與腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性

3 討論

NSCLC是肺癌中最常見的組織類型，國內(nèi)外的發(fā)病率和病死率均位居前列[9]。近年來，盡管肺癌的臨床診治方法得到了不斷提高與更新，也開始出現(xiàn)新的化療藥物及免疫治療藥物，但患者的整體預(yù)后仍不理想，這主要是由于多數(shù)患者在確診時已處于晚期階段[10-11]。目前，有關(guān)NSCLC的早期診斷和治療仍是中國乃至世界范圍需要迫切解決的一個重要難題。

細胞免疫系統(tǒng)是體內(nèi)對抗腫瘤細胞的重要武器，主要的免疫細胞包括T細胞、B細胞、NK細胞，而NK細胞又是抵抗腫瘤細胞的第一道防線[12-13]。NK細胞表面受體按功能不同分為活化性受體和抑制性受體，NK細胞的活化受活化性受體和抑制性受體表達的調(diào)控[14]，正常情況下，活化性受體的上調(diào)可激活NK細胞，從而發(fā)揮直接殺傷腫瘤的作用，而且活化的NK細胞還可以通過誘導(dǎo)多種細胞因子和趨化因子的釋放而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及殺傷靶細胞的作用[15-16]。本研究結(jié)果顯示，NSCLC組患者NK細胞活化性受體NKG2D、NKp30、NKp44表達均明顯低于對照組（P＜0.01），抑制性受體NKG2A、CD158a、CD158b表達均明顯高于對照組（P＜0.01），且不同TNM分期的NSCLC組患者外周血NK細胞受體表達存在明顯差異（P＜0.01），提示NK細胞活化性受體表達的降低和抑制性受體表達的升高可能與NSCLC的發(fā)生及疾病進展密切相關(guān)。

腫瘤標(biāo)志物是一種化學(xué)類物質(zhì)，對臨床疾病診斷和評估患者的預(yù)后有著重要意義[17]，近年來其也獲得了越來越多的關(guān)注，其中CEA、CYFRA21-1、NSE是用于輔助診斷NSCLC的常用腫瘤標(biāo)志物[18-19]。本研究結(jié)果顯示，NSCLC組患者血清腫瘤標(biāo)志物CEA、CYFRA21-1、NSE水平均明顯高于對照組（P＜0.01），這與以往的研究報道一致[20-21]。

然而，目前尚不清楚NSCLC患者外周血NK細胞表面受體與腫瘤標(biāo)志物的關(guān)系。本研究通過Pearson相關(guān)性分析研究了NSCLC患者外周血NK細胞受體表達與腫瘤標(biāo)志物的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NSCLC患者活化性受體NKG2D、NKp30、NKp44及抑制性受體CD158a、CD158b表達與腫瘤標(biāo)志物CEA、CYFRA21-1、NSE水平均無相關(guān)性（P＞0.05）；NSCLC患者抑制性受體NKG2A表達與CEA 水平呈正相關(guān)（P＜0.05），與 CYFRA21-1、NSE均無相關(guān)性（P＞0.05）。提示NK細胞表面受體與腫瘤標(biāo)志物有一定關(guān)系，但由于納入的樣本量有限需要在今后進行更大規(guī)模的驗證，以明確二者的關(guān)系。

綜上所述，NSCLC患者外周血NK細胞活化性受體表達降低，抑制性受體表達升高，其中活化性受體表達與腫瘤標(biāo)志物無相關(guān)性，抑制性受體NKG2A表達與腫瘤標(biāo)志物CEA呈正相關(guān)。