NSCLC患者基因突變與其臨床病理特征的相關性*

董躍華 王貴剛 楊燕君 魏玉磊 高永山 姜偉華

(河北北方學院附屬第一醫院胸心外科，河北 張家口 075000)

在我國惡性腫瘤發病及致死率中，肺癌居首位[1]。非小細胞肺癌(Non-small-cell lung carcinoma，NSCLC )則是肺癌中主要類型。雖手術、放化療等治療方式已應用多年，但整體療效不盡理想，且多數患者在初診之時已錯過治療最佳時機[2-5]。隨著人們對癌基因依賴研究不斷深入，EGFR基因靶向療法以其良好的藥物響應率及低副作用等特點逐漸成為NSCLC主要治療手段之一[6]。因此，對致癌基因的研究，尤其對致癌基因與病理分型及預后關系的探討，有助于在治療過程中篩選優勢人群[7-9]。Runx3是TGF-β信號通路中重要的調節因子之一，其表達缺失將限制Smad蛋白功能，干擾TGF-β信號通路的生物活性，導致腫瘤發生[10]。間質上皮轉化因子(Met)及下游信號通路的異常激活介導肺癌等多種腫瘤的演進，且Met基因擴增與EGFR敏感性突變患者耐藥性產生密切相關[11]。研究[12]顯示，TGF-β與HGF/c-Met信號通路在癌癥發展過程中存在負相關性。基于EGFR、Runx3、Met三者在NSCLC發病過程中的作用及聯系，本研究探討NSCLC患者EGFR、Runx3和Met突變情況與其病理分型、TNM分期及生存期的相關性，旨在為NSCLC的個體化靶向治療提供更多臨床依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年2月～2016年8月我院經手術途徑留取新鮮腫瘤標本96例。入選標準：①經術后病理確診為NSCLC。②亞裔患者。③未接受過分子靶向藥物、放療及化療藥物治療。④既往無身體其他部位惡性腫瘤病史。其中男性63例，女性33例；60歲以下41例，60歲及以上55例；吸煙32例，不吸煙64例。按照國際抗癌聯盟(UICC)(2016)分期標準[13]，Ⅰ期23例，Ⅱ期22例，Ⅲ期29例，Ⅳ期22 例。以2012年WHO制定的肺、胸膜、胸腺和心臟腫瘤病理學和遺傳學中對肺癌的組織學分型標準[14]，其中腺鱗癌3例，腺癌26例，鱗癌67例。本研究所有程序均經醫院的醫學倫理委員審核批準(BFFY20140027)。本研究入選患者對研究過程知情，且自愿簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 儀器：LightCycler?96全自動熒光定量PCR系統(Roche公司，96 通量)，切片機(德國萊卡公司，2135)，臺式高速度冷凍離心機(德國ELRCRON公司)，37℃恒溫培養箱(上海天呈科技有限公司)。試劑：免疫組化S-P試劑盒、胃蛋白酶、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，鼠抗人EGFR單克隆抗體、兔抗人Runx3單克隆抗體、鼠抗人Met單克隆抗體(上海基爾頓生物科技有限公司)，Trizol試劑(invitrogen公司)，多聚賴氨酸(Sigma公司)。

1.3 DNA 提取及基因突變檢測 將經10%中性福爾馬林固定的樣本進行常規HE染色，篩選出>50%腫瘤成分的瘤組織蠟塊切片。腫瘤組織切片后置于離心管保存，一抗孵育前經檸檬酸緩沖液(0.01 mol/L)進行抗原修復，采用免疫組化法測定EGFR、Runx3和Met表達。同時，對制備好的組織切片進行DNA提取，采用Nanodrop one測定DNA濃度，并以A260/A280值在1.8～2.0為有效值判斷純度。采用人多基因突變檢測通用試劑盒進行擴增，應用二代測序儀進行高通量測序。所有檢測依據試劑說明書及實驗室規范進行操作。

1.4 隨訪 以電話或門診形式進行隨訪，隨訪時間從病例確診至2019年12月31日。隨訪期間記錄患者后續治療、腫瘤轉移和復發等資料，并對患者的無進展生存時間進行統計。

2 結果

2.1 EGFR、Runx3和Met表達與臨床病理特征關系 EGFR表達與患者年齡、性別、吸煙史、分期、組織學分型、復發轉移、生存時間、病理分化均無關(P>0.05)；Runx3表達與分期、復發轉移有關(P<0.05)，與年齡、性別、吸煙史、組織學分型、生存時間、病理分化均無關(P>0.05)；Met表達與分期、組織學分型有關(P<0.05)，與患者年齡、性別、吸煙史、復發轉移、生存時間、病理分化均無關(P>0.05)，見表1。

表1 EGFR、Runx3和Met表達與臨床病理特征關系Table 1 Relationship between the expressions of EGFR，Runx3，Met and clinicopathological features of disease

2.2 EGFR、Runx3和Met突變情況與臨床病理特征的相關性 EGFR突變與患者組織學分型、生存時間有關(P<0.05)，與分期、復發轉移、病理分化無關(P>0.05)；Runx3突變與患者組織學分型、分期、復發轉移、生存時間有關(P<0.05)，與病理分化無關(P>0.05)；Met突變情況與患者組織學分型、分期、復發轉移、生存時間、病理分化均無關(P>0.05)。見表2。

表2 EGFR、Runx3和Met突變情況與臨床病理特征的相關性Table 2 Relationship between the mutations of EGFR，Runx3，Met and clinicopathological features of disease

2.3 EGFR、Runx3和Met表達和突變情況與患者生存時間的相關性 EGFR突變與Runx3突變與患者生存時間呈正相關(P<0.05)；Runx3的表達及突變與患者復發轉移呈正相關(P<0.05)，見表3。

表3 EGFR、Runx3和Met表達和突變情況與患者生存時間的相關性Table 3 Correlation between EGFR，Runx3 and Met expression and mutation status and patient survival time

3 討論

近年來，我國肺癌發病率、致死率逐年攀升[15]。自1991年起，我國的肺癌死亡率躍居各類癌癥之首，NSCLC占肺癌病理類型的80.85%。盡管NSCLC治療方法取得了不少進展，但NSCLC總的5年生存率仍低于15%[16]。高特異性、高療效、低毒性的分子靶向藥物能夠對腫瘤細胞特定靶點起效，成為腫瘤精準醫療的一大利器。以EGFR為分子靶標開發的EGFR酪氨酸激酶抑制劑是目前NSCLC治療中應用最廣泛、最典型的分子靶標藥物[17]。因此，深入研究致癌基因與病理分型及預后關系，對在NSCLC治療過程中篩選優勢人群頗有益處。

鑒于EGFR在NSCLC發生、發展中的作用，本研究探討了EGFR表達、突變與NSCLC病理分化、TNM分期、生存期等臨床病理特征的關系。結果顯示，EGFR表達在不同病理分化、TNM分期、生存期等臨床病理特征間無差異，但EGFR突變與組織學分型有關(P<0.05)，該結果與汪園園等[18]的研究一致。有學者[19]認為EGFR酪氨酸激酶編碼區基因突變是EGFR分子靶向藥物奏效的必要條件之一，推測亞裔女性、無吸煙史、腺癌患對EGFR酪氨酸激酶抑制劑可能有較高的藥物敏感反應，該推測在Seow等[20]研究中得以證實。

Runx3為重要的新進抑癌基因，以往研究[21]顯示，Runx3表達程度與肺癌患者生存率呈正相關，且Runx3低表達的患者肺癌復發轉移率高、癌細胞多為低分化。本研究結果顯示，Runx3表達與分期、復發轉移有關(P<0.05)，提示Runx3的表達在NSCLC的發生、發展中可能起重要作用。此外，本研究結果表明，Runx3突變與患者組織學分型、分期、復發轉移、生存時間有關(P<0.05)，60歲以下、腺癌患者Runx3突變率較高，與以往報道[22]相符。Tang等[23]研究則指出NSCLC的Ⅲ期患者比Ⅰ、Ⅱ期患者更容易發生Runx3突變，與本研究結果相一致。同時，本文結果表明，Runx3突變率在出現復發轉移、生存期低于三年患者中更高，證實了Runx3突變是預后不良的重要原因。

Met基因擴增是EGFR酪氨酸激酶抑制劑獲得性耐藥產生機制之一，此外，Met所介導的HGF/c-Met信號通路與Runx3參與的TGF-β通路在腫瘤發展過程中存在負相關性[24]。因此，Met基因在NSCLC發生發展及預后中更為關鍵。本研究發現，Met表達與分期、組織學分型有關(P<0.05)。Li等[25]研究表明，Met基因mRNA表達水平在腺癌患者中更高，且陽性率與患者TNM分期有關，與本研究研究結果相一致。目前對于Met基因突變與臨床病理特征之間是否擁有聯系尚無定論。本研究中Met基因突變率為2.6%～6.5%，與以往研究在NSCLC中的總發生率為3%～6%相符[26]。本文結果顯示，Met突變與病理分型、生存期等無關，可能由于Met總突變發生率較低，本文病例較少所致。因此，有關Met基因突變與臨床病理特征的影響有待后續進一步研究。

4 結論

NSCLC患者中EGFR突變可與Runx3、Met 突變共存，Met 突變率較低。EGFR突變與患者組織學分型、生存時間有關；Runx3突變與患者組織學分型、分期、復發轉移、生存時間有關。因此EGFR與Runx3的突變有望成為NSCLC患者組織學分型、判斷預后的潛在指標，為實施精準治療提供理論支撐。