肉羊屠宰場沙門菌的分離鑒定及其生物膜形成能力測定

馮雷喜，彭 斌，曹婉怡，姚 剛

（新疆農業大學動物醫學學院，烏魯木齊 830052）

沙門菌是一種重要的人畜共患病病原菌，可通過屠畜的糞便、皮毛等污染胴體和加工環境，并能夠在肉品接觸表面形成生物膜，引起交叉污染。調查羊屠宰場沙門菌的流行及測定分離株成膜能力，可為沙門菌防控提供參考。王晶晶等［1］對肉牛屠宰場76 株沙門菌的成膜能力進行測定，結果顯示全部菌株25 ℃和37 ℃下均能形成生物膜，沙門菌生物膜的安全風險較高。羊源沙門菌成膜能力的研究報道鮮見報道。本研究對新疆某肉羊屠宰場的沙門菌進行分離鑒定，并用結晶紫定量法對分離株生物膜能力進行測定，分析培養時間、溫度對羊源沙門菌成膜能力的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

2019 年3—10 月在新疆烏魯木齊市及其周邊羊屠宰場采集各類樣品共計1 389 份。用無菌生理鹽水浸潤的無菌棉簽旋入羊肛門并刮取內容物，在羊胴體表面刮取以及于羊腸道內容物取樣，將棉拭子插入含有5 mL 甘油肉湯的離心管中并標記，置于備有冰袋的泡沫盒中，12 h 內運回實驗室。

四硫磺酸鈉煌綠增菌液基礎（TTB）、亞砷酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、亞硫酸鉍瓊脂（BS）、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（XLD）、緩沖蛋白胨水（BPW）等均購于青島日水生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 沙門菌分離鑒定 沙門菌檢驗按照國家標準方法（GB 4789.4—2016）挑取可疑菌落。

1.2.2 inv-A 鑒定 挑取平板上可疑單菌落于50 μL TE Buffer 的八連管內，置于PCR 儀95 ℃變性15 min，取出冰浴10 min，即DNA 模板，-20 ℃保存備用。利用PCR 技術對沙門菌DNA 片段進行擴增（保守基因inv-A）。將5 μL PCR 產物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增片段由上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.3 沙門菌生物膜形成能力測定方法 將凍存菌株接種于BHI（pH=7.0）培養液中，于37 ℃培養18 h進行活化，2 次活化后在37 ℃培養液中隨時間的推移對生物膜的形成進行測定。

生物膜的制備。用96 孔板結晶紫染色法，以陰性組均值加上其3 倍標準差為成膜標準，進行測定，OD＜OD 標準，為不成膜株；OD 標準＜OD＜2 OD標準，為弱成膜株；2 OD 標準＜OD＜3 OD 標準，為強成膜株。

1.3 試驗設計

將沙門菌分離株在37 ℃條件下分別培養24、48、72 h 與4 、25、37 ℃溫度下培養72 h 后對其成膜能力進行測定，分析培養時間和培養溫度對成膜能力的影響。

1.4 數據處理

利用酶標儀測定樣品OD，數據用平均值±標準偏差表示，采用統計分析軟件GraphPad Prism 8.0.1進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 分離鑒定結果

2.1.1 培養基分離結果 在XLD 培養基上形成黑色有金屬光澤的菌落（圖1），BS 瓊脂上形成有金屬光澤的黑色菌落（圖2），為疑似沙門菌。

圖1 沙門菌菌落形態（XLD）

圖2 沙門菌菌落形態（BS）

2.1.2invA鑒定結果 對疑似沙門菌分離株進行invA基因PCR 鑒定，結果顯示54 株擴增得到約284 bp 的片段，與預期大小一致（圖3）。

圖3 部分樣品invA 基因擴增鑒定結果

本研究從1 389 份樣品中分離出54 株沙門菌，總分離率為3.89%。

2.2 沙門菌成膜鑒定結果

2.2.1 沙門菌37 ℃不同培養時間OD測定結果 54株試驗沙門菌在37 ℃、72 h 培養下，其強成膜株、弱成膜株和不成膜菌株占比分別為55.56%、40.74%、3.70%；培 養48 h 占 比 分 別 為46.30%、50.00%、3.70%。培養24 h 占比分別為44.44%、44.44%、11.11%（表1）。沙門菌在37 ℃條件下經72 h 培養后OD最高，其成膜能力極顯著高于48（P＜0.001）、24 h（P＜0.001）；其中48 h 成膜能力顯著高于24 h（P＜0.01）（圖4）。37 ℃培養條件下，沙門菌成膜能力受時間的影響較大，且隨時間增加成膜能力逐漸增強。

表1 37 ℃不同培養時間沙門菌成膜能力

圖4 37 ℃培養不同時間生物膜形成能力

2.2.2 沙門菌72 h 下不同培養溫度OD測定結果54 株試驗沙門菌在4 ℃培養下，強成膜株、弱成膜株、不成膜菌株占比分別為29.63%、20.37%、50.00%；25 ℃培養下占比分別為62.96%、37.04%、0%。在37 ℃培養下占比分別為55.56%、40.74%、3.70%（表2）。 經72 h 培養，25 ℃培養條件下OD值最高，沙門菌分離株成膜能力極顯著高于37（P＜0.001）、4℃（P＜0.001）；37 ℃和4 ℃條件下成膜能力差異不顯著（P＞0.05）。

表2 72 h 下不同溫度沙門菌成膜能力

圖5 72 h 培養不同溫度生物膜形成能力

3 討論

3.1 沙門菌污染率調查分析

王晶晶等［1］研究發現，在四川部分地區山羊沙門菌檢出率為54.59%；新疆石河子某羊場沙門菌檢出率為51.5%［2］；儲倩等［3］研究發現，某屠宰場沙門菌攜帶率為50%。吳美云［4］進行沙門菌的分離鑒定，檢出率為10.9%；匡秀華［5］研究發現，分離率為25.12%。本研究發現，新疆部分屠宰場羊肉污染率為3.89%（54/1389），與國內報道食源性沙門菌結果差異較明顯。中國不同地域、品種沙門菌均有分布，本研究雖檢出率較低，但仍需加強對沙門菌的監測與預防。

3.2 37 ℃條件下不同培養時間沙門菌與生物膜形成能力的關系

本研究發現，在37 ℃培養條件下，不同培養時間沙門菌生物膜形成能力差異顯著，且生物膜的形成能力會隨著培養時間的增加而顯著增強。這可能是由于細菌胞體表面的物理、化學特性，導致細菌與黏附表面的相互作用從而影響沙門菌的黏附和生物膜的形成［6］。

3.3 72 h 培養條件下不同溫度沙門菌與生物膜形成能力的關系

本研究發現，25 ℃是沙門菌形成生物膜的最佳溫度，生物膜形成能力最強，該結果對肉制品產業鏈以及檢測機構有重要意義。結合生物膜測定結果，培養時間顯著影響其成膜能力，與尹彬茹［7］研究結果一致。由于生物膜極易引起二次污染［8］，研究生物膜形成能力具有重要指導意義。有利條件可促使沙門菌的多細胞形態生成，在28 ℃下能夠產生細聚合菌毛促進生物膜形成［9-11］。研究發現，沙門菌在37 ℃條件下生物膜形成能力一般［12］，本研究發現37 ℃條件下沙門菌形成生物膜的能力隨時間增加逐漸增強。

4 小結

本研究中羊肉屠宰場中沙門菌檢出率為3.89%（54/1389），存在一定程度的污染，需要加強對沙門菌的監測與預防。在中性（pH=7.0）環境中，沙門菌分離株經37 ℃培養隨培養時間延長生物膜形成能力逐漸增強；經72 h培養條件下25 ℃時成膜能力最強。