苜蓿提取液對大腸埃希菌體外抑菌活性

劉耀川，龔商羽，關 淼，楊洺揚，申貫男，李 旭，郭首龍

（1.遼寧省動物疫病預防控制中心，沈陽 110164；2.錦州市動物疫病預防控制中心，遼寧 錦州 121000）

大腸埃希菌是自然界廣泛存在的一種共棲型微生物，通常為條件性致病菌，以其他疾病的并發致病菌或繼發致病菌的形勢存在［1］。該菌血清型眾多，其中部分特殊血清型的大腸埃希菌能引起人和動物感染，而 O1、O2、O18 及 O78 則是引起禽大腸桿菌病的主要病原。該病是禽類養殖過程中的常發疾病，具有較高的發病率及死亡率，給禽類養殖業帶來較大的經濟損失［2］。獸醫臨床仍然選擇抗生素作為禽大腸桿菌病的主要治療手段，隨著抗生素的使用，大腸埃希菌在藥物選擇壓力的作用下逐漸產生耐藥性，給畜牧養殖業造成嚴重威脅，急需尋找有效的抗生素替代治療方案。

苜蓿（Medicago sativa）是種植面積廣泛的優良牧草，具有較好的環境適應能力及較高的營養價值。同時作為古籍記載的中藥，苜蓿具有較好的清熱、通淋、利血等功效，對黃疸、尿路結石、細菌性腹瀉等疾病有一定療效。本試驗對苜蓿提取液體外抑菌活性進行研究，旨在為苜蓿精加工及減抗治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Eppendorf 5810R 冷凍低溫離心機，北京鵬昆科貿生產；艾龍特QG-H 生物安全柜，山東濰坊醫療器械廠生產；DZ-380L-X 高壓立式蒸汽滅菌器，上海申安醫療生產；Herocell 180DX 隔水式恒溫電熱培養箱，上海潤度生物科技有限公司生產；精科752N 紫外/可見光分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司生產；KQ-450DX 數控超聲波清洗器，舟山市超聲儀器有限公司生產；SHV-IB 型雙A 循環水多用真空泵，鄭州長宏科貿有限公司生產；艾本德 10、200、1 000 μL 微量移液器，青島興達生物科技生產。

1.2 主要試劑

營養肉湯（NB）、麥康凱瓊脂粉、營養瓊脂（NA）于北京奧博星生物技術有限責任公司購買；腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管于杭州濱和微生物試劑有限公司購買；蘆丁對照品（批號F20201108）于國藥集團購買；其他化學常用試劑如氫氧化鈉、乙醇（分析純）、氯化鋁、亞硝酸鈉等，由遼寧省動物疫病預防控制中心提供。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁標準曲線的繪制 精確稱取蘆丁標準品0.100 4 g，定容于50 mL 容量瓶中，充分搖勻后3 倍稀釋，所得蘆丁標準溶液的質量濃度為0.67 g/L［3］。

分別取配置好的標準溶液 2、4、6、8、10、12 及14 mL 于50 mL 容量瓶中。按照5 mL 5% NaNO26 min、10 mL 1% Al（NO3）36 min、20 mL 4% NaOH 15 min 的順序進行反應后，定容、搖勻。以ddH2O 為對照，在510 nm 波長處測定其OD值，繪制標準曲線［4］。

1.3.2 苜蓿黃酮化合物提取及濃度測定 根據董曉寧等［5］報道的最佳提取方案，按照液料比1∶45、乙醇體積分數55%、超聲提取時間50 min 的工藝對苜蓿進行提取。具體方法為，精確稱量10 g 苜蓿粉末，在燒杯中加入55%的乙醇溶液，封口靜置于室溫環境浸泡5 h。將浸泡液于300 W 功率超聲處理50 min，減壓抽濾后進行旋轉蒸發，直至濃縮液無明顯乙醇味后，將濃縮液于錐形瓶中用0.02 g 活性炭進行脫色處理。定容50 mL 后，用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法處理，在510 nm 處測定OD值，根據標準曲線測定黃酮化合物含量。

1.3.3 培養基制備 將營養肉湯、營養瓊脂、麥康凱瓊脂按照說明書要求配置成相應濃度培養基，經121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min 后分裝于離心管及制成相應的固體培養基。并將裝有營養瓊脂的離心管、固體麥康凱培養基及固體營養瓊脂培養基放置于37 ℃恒溫培養箱中過夜檢菌。將檢菌合格的培養基密封，保存于4 ℃冰箱內備用。

1.3.4 大腸埃希菌分離及鑒定 用無菌棉拭子取患病雞泄殖腔樣品，并將棉拭子置于盛有無菌生理鹽水的離心管中4 ℃密封保存并盡快送至實驗室。在潔凈工作臺中取100 μL 生理鹽水樣品，用三角玻璃棒均勻涂布于普通瓊脂培養基中，并于37 ℃恒溫培養箱中培養12 h。選取菌落大小、形狀不同的單菌落于無菌NB 中進行擴增培養，并將培養液于麥康凱瓊脂培養基進行初步鑒別培養，培養方法及條件與普通瓊脂培養基方式相同。選取麥康凱培養基中圓形且具有紅色金屬光澤的單獨菌落，對其進行生化反應鑒定。根據顏色反應及編碼手冊對應編碼，最終確定大腸埃希菌分離株。

1.3.5 體外抑菌活性研究 將大腸埃希菌分離株接種于無菌NB 肉湯中，于37 ℃振蕩培養箱中180 r/min 過夜培養。取 100 μL 渾濁 NB 培養液，均勻涂布于普通瓊脂培養基中，于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h 進行菌株復壯。

取復壯后的單獨菌落于NB 肉湯中振蕩培養，用無菌NB 肉湯為對照測定培養物OD值，待菌液OD600nm為0.4～0.6，此時菌液濃度約為1×108CFU/mL，可用于藥物敏感性試驗。參考美國CLSI 2019 年推薦的微量肉湯稀釋法測定苜蓿提取液對大腸埃希菌分離株的最小抑菌濃度（MIC），以大腸埃希菌標準株ATCC25922 為質控菌，設置氨芐西林標準品為對照。

2 結果與分析

2.1 苜蓿提取液黃酮化合物含量

根據蘆丁標準品繪制的標準曲線，以及用蘆丁比色法測定的苜蓿提取液吸光度，測得苜蓿提取液中黃酮類化合物含量為9.63 mg/mL。

2.2 大腸埃希菌分離鑒定結果

在63 個臨床病例的泄殖腔棉拭子中，經麥康凱瓊脂鑒別培養基初步分離到大腸埃希菌52 株。52株大腸埃希菌疑似分離株經腸桿菌科生化反應鑒定培養、編碼比對，最終確定大腸埃希菌分離株42 株，大腸埃希菌分離率為66.7%。

2.3 苜蓿提取液體外抑菌活性

采用微量肉湯稀釋法分別測定氨芐西林標準品和苜蓿提取液對42 株大腸埃希菌分離株的MIC，以大腸桿菌標準株ATCC25922 作為質控菌。結果表明，氨芐西林標準品對質控菌的MIC 為0.25 mg/L，符合CLSI評估范圍，證明該數據及試驗操作可信。

氨芐西林標準品對42 株大腸埃希菌分離株的MIC50和 MIC90分別為 0.5、8.0 mg/L，其整體 MIC 為0.125～64.000 mg/L，部分分離株對氨芐西林已產生耐藥性。

本研究苜蓿提取物按其黃酮化合物含量計算，原液初始濃度為9 630 mg/L。按倍比稀釋計算，抑菌活性研究中工作液濃度為9.404～9 630.000 mg/L。其對大腸埃希菌分離株MIC50和MIC90分別為1 203.75、4 815.00 mg/L，其MIC為601.87～9 630.00 mg/L（表1）。

表1 大腸埃希菌分離株體外抑菌活性研究結果

3 討論

禽大腸桿菌病是由大腸埃希菌引起的一類原發或繼發性禽類傳染病，其主要癥狀為心包炎、滑膜炎、大腸桿菌性肉芽腫、臍炎、蜂窩組織炎等，對規模化養殖威脅巨大。隨著大腸埃希菌耐藥菌株的出現，該病的治療也愈發困難。苜蓿是一種在中國分布較廣的多年生草本植物，在中國畜禽養殖業已作為優良牧草長期使用。近代醫學研究發現，其含有的活性物質對常見病原菌及耐藥性病原菌具有一定的抑制功能。楊蕾等［6］報道苜蓿黃酮提取物對云南地區分離的枯草芽孢桿菌、普通變形桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的MIC 分別為1.5、1.5、3.0、2.0 和 2.5 mg/mL；廖天錄等［7］報道航天苜蓿中黃酮提取物對甘肅地區大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的 MIC 為 0.4 和 0.7 mg/mL；李波等［8］報道苜蓿皂苷提取物對齊齊哈爾地區大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌的 MIC 分別為 0.024 0、0.047 9 mg/mL，對真菌無明顯抑制效果；盧小康等［9］報道苜蓿提取液對甘肅地區綠膿桿菌、停乳鏈球菌、大腸埃希菌及金黃色葡萄球菌的 MIC 分別為 0.674、1.347、2.695 及2.695 mg/mL；王家皓等［10］報道南苜蓿葉總黃酮提取物對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌標準株的MIC 分別為0.15、0.20 mg/mL。

本試驗苜蓿黃酮提取液對禽源大腸埃希菌分離株的 MIC50和 MIC90分別為 1 203.75 、4 815.00 mg/L，對苜蓿提取液體外抑菌活性研究發現，提取液對臨床分離的大腸埃希菌具有一定的抑制效果，部分分離株對提取液敏感性較高，在相對較低濃度時（601.87 mg/L）就出現明顯的生長抑制效果。而部分分離株則對提取液不敏感，在初始工作濃度時仍正常生長，未見明顯的生長抑制現象。對氨芐西林耐藥菌株MIC 分析，并未發現明顯的耐藥菌株抑制活性，即對部分氨芐西林耐藥菌株表現出生長抑制效果，而對部分氨芐西林耐藥菌株未見生長抑制。分析可能是黃酮類化合物抑菌機制與β-內酰胺類抗生素抑菌機制不同。