高效液相色譜-串聯質譜法檢測奶牛糞污及降解產物中雌激素

邵志勇，周 源，何 斌，吳利軍，楊文海，陳夏冰，劉 武，金爾光

（武漢市農業科學院畜牧獸醫研究所，武漢 430208）

隨著人民生活水平逐漸提高，人們對肉、蛋、奶的需求量日益增加，刺激畜牧業朝著集約化方向快速擴展［1］，同時帶來大量的畜禽糞污，造成的環境污染問題日益凸顯。對畜禽糞污的污染仍主要集中在N、P、重金屬和農藥等常規污染物的研究和控制，雌激素等污染物未得到足夠的重視［2］。環境中的雌激素屬于典型的內分泌干擾物，具有較強的生態和生理毒性，可以打破生物體自身的平穩狀態，使各個平穩運行的系統失去穩定狀態［3］，從而導致男性不育、女性生殖器官腫瘤、兒童早熟，野生動物繁殖能力下降及水生生物雌性化等生殖疾病［4］。據統計，美國禽畜養殖場排泄產生的雌激素量約為污水處理廠排放的10 倍［5］，其中，奶牛糞污中的雌激素占畜禽糞污中雌激素的90%［6］。

用于動物性食品、液體樣品中雌激素的檢測方法較多，有氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜串聯質譜法（GC-MS）、高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/MS）、電感耦合等離子發射光譜法（ICP）、電感耦合等離子體串聯質譜法（ICP-MS）［7，8］，但關于奶牛糞污中雌激素的檢測方法鮮有報道。為保障人類和動物的生殖代謝等健康問題，建立一種奶牛糞污及其降解產物中雌激素含量檢測方法至關重要。本研究使用高效液相色譜-串聯質譜法對奶牛糞污及其降解產物樣品中雌酮、17-α-雌二醇、17-β-雌二醇、雌三醇4 種天然雌激素的檢測方法進行研究，對奶牛糞污的安全處理與資源化利用的安全評價有積極意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

MS205DU 電子天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；SB-5200D 超聲波清洗儀，寧波新芝生物科技有限公司；RE-52AA 旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；QYCQ-24B+DP-01 固相萃取裝置，上海喬躍電子有限公司；ZX-DC 氮吹儀北京眾信佳儀科技有限公司；Acquity UPLC Xevo TQ-S 高效液相色譜-質譜聯用儀（配電子噴霧離子源），美國Waters 公司；Milli-Q 純水儀，美國Millipore 公司；3K15 高速冷凍離心機，美國Sigma 公司；Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），美國Waters 公司。

雌酮（純度1 000 μg/mL，CAS 號53-16-7），17-α-雌二醇（純度1 000 μg/mL，CAS 號57-91-0），雌三醇（純度1 000 μg/mL，CAS 號50-27-1），購于美國o2si smart solutions 公司；17-β-雌二醇（純度100 μg/mL，CAS 號50-28-2），購于法國A2S Analytical Stan?dard Solutions 公司；17-雌三醇-D2（純度≥98%，79037-36-8），購于上海甄準生物科技有限公司；17-β -雌 二 醇-D2（純 度1 000 μg/mL，CAS 號53866-33-4），北京曼哈格生物科技有限公司；雌酮-D2（純度100 μg/mL，CAS 號56588-58-0），壇墨質檢科技股份有限公司；乙腈、甲醇購于美國Ther?mo Fisher 公司。氯化鈉、氨水、鹽酸、冰乙酸等試劑均為分析純；試驗用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制 移取3 種內標對照品200 μL 至10.00 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配置成濃度為2 μg/mL 的內標溶液。

雌三醇、雌酮、17-β-雌二醇的混合對照品溶液儲備液的配制，移取3 種激素的混合對照品溶液200 μL 于10.00 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，并逐級稀釋，濃度依次為0、2、5、20、50、100 和200 ng/mL。所有濃度的激素混合標準溶液中均加入50 μL 的內標溶液。

17-α-雌二醇的混合對照品溶液儲備液的配制，移取17-α-雌二醇的混合對照品溶液200 μL 于10.00 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，并逐級稀釋，濃度依次為0、20、50、100、200、500 和1 000 ng/mL。以上所有濃度的激素混合標準溶液中均加入50 μL 的內標溶液。

1.2.2 樣品前處理 分別采集哺乳牛、犢牛糞樣各3 份，發酵床上層和下層樣品各1 份，約500 g 做為代表性樣品，黑色塑料袋密封，并立即存放于冰盒中冷藏存放，然后保持冷凍狀態盡快運回實驗室，并冷凍干燥處理。凍干后的樣品避光保存，分析前用高速粉碎機將其粉碎，過篩，使其粒徑小于2 mm ，混合均勻后縮分至100 g，儲存于樣品瓶中，密封保存，供檢測用。

稱取2.00 g 樣品，加入50 μL 氘代內標，再加入20 mL 乙腈，振蕩1 h，離心，取上清液10 mL，氮吹近干，加入30%甲醇水溶液5 mL，待凈化。

1.2.3 樣品凈化 預先用以5 mL 乙酸乙酯、5 mL 甲醇、5 mL pH 2.0 鹽酸溶液活化HLB 小柱，取備用液上柱，以5 mL 30%甲醇水溶液洗滌，抽至近干后加入3 mL 的石油醚洗滌，將小柱抽干，再用5 mL 乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液于玻璃離心管中，氮吹至近干，用2 mL 50%甲醇水溶液溶解，過膜，上機檢測。

1.2.4 檢測條件 液相色譜條件，C18 柱，柱長100 mm，內徑2.1 mm，粒徑1.8 μm；流速為0.4 mL/min；進樣量為10 μL；柱溫為35 ℃。梯度洗脫程序見表1。

質譜條件，電噴霧離子源，負離子模式；脫溶劑氣溫度500 ℃；脫溶劑氣、錐孔氣均為高純氮氣；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣流速1 000 L/h；錐孔氣流速150 L/h；碰撞氣流速0.13 mL/min；多反應監測（MRM）模式，監測條件見表2。4 種激素在MRM 條件下色譜見圖1。

圖1 奶牛糞污中4 種激素色譜

表2 多反應監測條件

2 結果與分析

2.1 標準曲線和定量限

由于奶牛糞污及降解產物中的激素是一種內源性物質，很難獲得不含激素的空白試樣用于檢出限的評定。通過添加含有氘代的標準溶液，按照梯度稀釋，高效液相色譜-串聯質譜分析，4 種激素均呈現了良好的線性關系（R2>0.99）（表3）。

由表3 可知，雌三醇、雌酮、17-β-雌二醇的曲線以濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，在2~200 ng/mL內線性關系良好，17-α-雌二醇的曲線以濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，在20~1 000 ng/mL 內線性關系良好（R2≥0.995）。

表3 標準曲線方程和相關系數

采用空白基質提取液逐級稀釋標準溶液的方法確定定量限，雌三醇、雌酮、17-β-雌二醇的定量限為2 ng/mL；17-α-雌二醇的定量限為20 ng/mL。

2.2 回收率

稱取牛糞3 份，每份2.00 g 樣品（偏差最大0.02 g），3 份樣品中分別加入100、50 和0 μL 激素混合標準品，每份樣品加入50 μL 氘代內標，充分混勻后靜置2 h，4 種激素的平均回收率為93.6%～145.3%，表明該方法具有良好的檢測性能（表4）。

表4 回收率

2.3 奶牛糞污及降解產物中雌激素的測定結果

將奶牛糞污及微生物異位發酵床中的樣品經預處理和色譜條件提取并檢測。結果發現，在犢牛糞中未檢出雌酮，而哺乳牛糞中檢出雌酮；犢牛雌三醇的檢出量高于哺乳牛；犢牛的雌激素總檢出量低于哺乳牛，與王真［9］研究結果不一致，與李艷等［10］研究結果一致；梁紫薇等［11］研究發現，在相同品種、相同飼喂方式下，不同季節肉雞雌激素的排放量也存在較大差異。

樣品中雌激素檢查結果見表5。由表5 可知，發酵后的牛糞雌激素總檢出量低于犢牛、哺乳牛，發酵床上層樣品中只有17-β-雌二醇未檢出，其他3 種雌激素檢出，發酵床下層樣品均未檢出，可能受發酵床中微生物影響，與郭立泉等［12］研究結果一致，說明生物發酵床對相關雌激素具有一定降解功能。

表5 奶牛糞污及降解產物中激素檢測結果

3 結論

LC-MS/MS 技術擁有高靈敏度、高分辨率、高特異性和高效分離等特點［13］，被用于實現解析化合物分子結構或樣品的定性定量分析。利用其特性與實際情況相結合，建立了一種用高效液相色譜-串聯質譜法檢測奶牛糞污及降解產物中4 種天然激素的檢測方法，該方法對樣品中雌三醇、雌酮、17-β-雌二醇的檢出限為2 ng/mL，17-α-雌二醇的檢出限為20 ng/mL，加50 μL 氘代內標時，回收率為93.6%～145.3%。運用該方法對奶牛場糞污及微生物異位發酵床墊料中的激素殘留進行檢測，部分未檢出。該方法可用于奶牛糞污及降解產物中激素殘留的檢測，方法靈敏度高、檢出限低，為奶牛糞污及降解產物中激素的測定提供了一種高效、簡便的檢測方法。