蜂蜜中嗜滲酵母計數的培養基優化及方法比較

陸 雯，李秀通，彭醒醒，胡淑紅，周婷婷，王 珍

（綠城農科檢測技術有限公司，杭州 310000）

蜂蜜中出現的酵母主要有嗜滲酵母（Osmophil?ic yeast）和耐高糖酵母（Sugar-tolerant yeasts）［1］，其中嗜滲酵母對蜂蜜品質影響較大［2］。新的國家標準增加嗜滲酵母計數限量要求，也是進一步提高蜂蜜產品安全性的需要［3，4］。

嗜滲酵母計數的檢測主要依據GB14963—201l《食品安全國家標準蜂蜜》附錄A 規定的方法進行。該方法采用常規取樣稀釋后，取0.1 mL 進行平板涂布培養，最低檢測限量<100 CFU/g，而GB 14963—2011 中嗜滲酵母限量為≤200 CFU/g［5］，在最高稀釋倍數（10-2）平板上長出3~14 個菌落，表明結果超限量，而這些數值不在標準規則要求中，即檢測過程偏離標準要求。此外，取0.1 mL 進行涂布的操作過程，誤差較大，方法結果準確度較低，菌落與DG18 瓊脂平板背景色差不明顯等，無論是對檢測機構的檢測及判斷評判還是對監督執法部門的公正執法都具有一定的風險。此外，國標方法中對嗜滲酵母的培養條件為25±1 ℃恒溫培養箱中培養7 d，較一般的菌落培養周期長。因此，為縮短培養周期及降低檢測限，迫切需要對蜂蜜中嗜滲酵母的計數方法進一步研究。研究表明，生物素有利于釀酒酵母的生長［6，7］，而孟加拉紅被廣泛用于霉菌酵母的培養基中，可使生長的菌落背面顯出較濃的紅色，有助于計數。本研究通過比較涂布法［5，8］、傾注法［9］、濾膜法［10］的計數結果以獲得最佳的操作方法以及在培養基中添加一定含量的生物素和孟加拉紅從而改進培養基配方以獲得更適合嗜滲酵母計數的培養基。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種來源 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisi?aeCICC 1346）由中國工業微生物菌種保藏管理中心提供。

1.1.2 樣品 人工污染嗜滲酵母的蜂蜜及自然界污染嗜滲酵母的蜂蜜。

1.1.3 培養基 30%的葡萄糖溶液（pH 6.5±0.5）、氯硝胺18%甘油（DG18）、瓊脂購自青島海博生物技術有限公司；馬鈴薯浸出粉、酪蛋白胨、無水葡萄糖、硫酸二氫銨、硫酸鎂、氯硝胺、無水甘油、氯霉素、孟加拉紅購自國藥集團化學試劑有限公司；生物素購自Sigma 公司。

1.1.4 儀器與設備 生化培養箱（LRH-250F，上海一恒）；拍擊氏均質器（BagnMixer400CC，法國inter?science）；電子天平（BSA224S，德國賽多利斯）；精密移液器（Eppendorf）；微生物限度儀（HTY-302 型，杭州泰林）。

1.2 方法

1.2.1 取樣 無菌稱取25 g 樣品于225 mL 30%葡萄糖稀釋液中，均質拍打2 min，制備成1∶10 的稀釋液。用無菌吸管吸取1∶10 稀釋液1 mL，加入9 mL 30%葡萄糖無菌稀釋液漩渦混勻制成1∶100 的稀釋液，依此方法可進一步稀釋。濾膜法的樣品稀釋為，用無菌吸管吸取1∶10稀釋液10 mL加入90 mL 30%葡萄糖無菌稀釋液漩渦混勻制成1∶100 的稀釋液，依此方法可進一步稀釋。

1.2.2 涂布法 根據樣品污染情況選擇合適稀釋梯度，吸取0.1 mL 稀釋液于DG18 瓊脂平板上，用無菌涂抹棒在平板表面均勻涂布，同一稀釋度接種2 塊平板，同時吸取0.1 mL 30%葡萄糖稀釋液于新的DG18 瓊脂平板，相同方法涂布作為空白對照。

1.2.3 傾注法 選擇合適稀釋度的稀釋液，吸取1 mL 稀釋液于無菌平皿中，同一稀釋度接種2 塊平板，同時吸取1 mL 30%葡萄糖稀釋液于新的空白平皿中作為空白對照，將配制好并冷卻至46 ℃左右的DG18 培養基傾注于加好稀釋液的培養基中，每塊平皿傾注20 mL 左右，并輕輕轉動平皿使稀釋液與培養基混合均勻。

1.2.4 濾膜法 用無菌鑷子夾取0.45 μm 滅菌濾膜邊緣部分，將粗糙面向上，貼放在已滅菌的濾床上，固定濾杯，將100 mL 稀釋液傾入濾杯過濾，用100 mL 無菌水分3 次潤洗稀釋液容器，將潤洗液繼續過濾，將過濾后的濾膜貼在已制備好的DG18 平板上，平鋪并避免在濾膜和培養基間夾留氣泡。

1.2.5 培養 接種完后將平板置于25±1 ℃恒溫培養箱中暗培養7 d，于48 h 后逐日觀察。

1.2.6 菌落計數 根據嗜滲酵母的菌落形態計數，對于難判斷的菌落選擇顯微鏡檢進一步確認。

1.3 培養基優選

1.3.1 培養基組分 比較氯硝胺18%甘油（DG18）瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）及孟加拉紅培養基（RBM）的組分，確定新的培養基組分（g/L）為馬鈴薯浸出粉12 g，酪蛋白胨5.0 g，無水葡萄糖10.0 g，硫酸二氫銨1.0 g，硫酸鎂0.5 g，氯硝胺0.1 g，無水甘油200 g，瓊脂15 g，氯霉素0.1 g，孟加拉紅0.033 g，生物素的量通過單因素試驗確定，組成新的培養基名稱為PDMG18。

1.3.2 單因素試驗 在已確定組分的基礎上，分別添加生物素0.005、0.010、0.015、0.020 μg。分別用涂布法、傾注法和濾膜法計數。

1.3.3 PDMG18 與DG18 培養基比較 相同操作方式及培養條件下，分別計數優化后的培養基（PDMG18）及DG18 培養基上的嗜滲酵母，比較菌落在2種培養基上的生長特點及同一梯度下的數量差異。

2 結果與分析

2.1 3 種方法檢測限比較

制備適當濃度的菌懸液采用涂布法、傾注法和濾膜法分別進行蜂蜜中嗜滲酵母計數，每種方法均進行3 次平行試驗，當菌落數在小于100 CFU/g 時，涂布法無法獲得準確的菌落數，而傾注法與過濾法可以得到具體的菌落數，結果見表1。

表1 3 種方法檢測嗜滲酵母的檢測限

2.2 模擬污染嗜滲酵母的蜂蜜檢測

在蜂蜜中添加嗜滲酵母制備成人工污染的蜂蜜，通過3 種方法檢測嗜滲酵母，結果見表2。由表2可知，濾膜法培養后檢出的菌落數較涂布法多，傾注法檢出的菌落數最少。涂布法在操作過程中添加至平板上的稀釋液僅為0.1 mL，對于吸液的器具量程精確度較高，而用涂布棒涂布過程中，涂布棒涂布完成后棒體上會附著部分樣液，造成實際樣液小于0.1 mL 而影響檢測結果。相較于涂布法，傾注法吸取的稀釋液為每平皿1 mL，吸液誤差較小，但對于培養基的溫度要求較高，一般傾注培養基溫度在46 ℃，可能會造成部分嗜滲酵母死亡，影響檢測結果。濾膜法的稀釋液為100 mL，且稀釋液容器經過多次潤洗收集，過程中的誤差最小，最能反應樣品中真實的嗜滲酵母數量。

表2 3 種方法檢測被污染的蜂蜜中嗜滲酵母結果

2.3 PDGM18 培養基組分的確定

不同生物素含量對嗜滲酵母計數的影響見表3。由表3 可知，通過單因素試驗，發現在其他組分量確定的情況下，生物素添加量為0.010 μg 時檢出的嗜滲酵母數量最多，且菌落生長狀況最佳。生物素為酵母生長所必需的營養素，不耐熱，需要過濾滅菌后控制培養基溫度在46 ℃左右時添加，經混勻后傾注平皿。

表3 不同生物素含量對嗜滲酵母計數的影響（單位：CFU/g）

2.4 PDGM18 培養時間對嗜滲酵母計數的影響

制備適當濃度的菌懸液，利用PDMG18 培養基采用涂布法、傾注法和濾膜法分別進行蜂蜜中嗜滲酵母計數，每種方法均進行3 次平行試驗，于25 ±1 ℃恒溫培養箱中培養7 d，于48 h 后逐日觀察，結果見表4。由表4 可知，培養2 d 肉眼可見有菌落生長，但因菌落過小無法計數，培養3 d 能清晰計數，且直至7 d 數據無明顯變化。

表4 PDGM18 培養時間對嗜滲酵母計數的影響 （單位：CFU/g）

2.5 PDMG18與DG18瓊脂平板測定嗜滲酵母的比較

制備同一濃度的菌懸液，準備PDMG18 培養基與DG18 培養基，分別用涂布法、傾注法、濾膜法分別測定，結果見圖1。由圖1 可知，3 種方法中利用PDGM18 培養基測定的數據均比DG18 培養基測定的高。培養至2 d，PDGM18 培養基上的菌落能肉眼可見，但菌落較小無法計數，培養至3 d，PDGM18 培養基上的菌落較清晰可見，可進行計數；在DG18 培養基上，培養至4 d 菌落能肉眼可見，可進行計數。相較于DG18 培養基，PDGM18 培養基可將計數時間提前1 d（圖2）。

圖1 3種方法分別用DG18與PDMG18檢測嗜滲酵母的結果

圖2 DG18 與PDMG18 上嗜滲酵母的生長情況

3 討論

嗜滲酵母是蜂蜜發酵的主要原因［11，12］，2017 年嗜滲酵母被食品藥品監管總局列入蜂蜜檢驗項目中。國家食品藥品監督管理總局官網上公布數據顯示，國家食品安全監督抽檢不合格產品中嗜滲酵母占不合格蜂產品比例約為12.65%；食品安全監督抽檢不合格產品中嗜滲酵母占不合格蜂蜜比例約為14.65%［13］。針對蜂蜜嗜滲酵母計數的國標方法檢測限較高，檢測時間較長，需要建立檢測效率較高且檢測限低的方法。通過3 種方法檢測限比較，涂布法、傾注法及濾膜法最大檢測限量分別<100 CFU/g、<10 CFU/g、<1 CFU/g。涂布法受限于接種量且涂布誤差較大；傾注法受培養基溫度的影響較大且菌落生長在培養基內，現有培養基DG18 的顏色與菌落顏色接近，影響觀察與計數；濾膜法不受接種量的限制，可以通過改變取樣量達到最大檢測量，且可反復沖洗樣品容器減少殘留誤差，但操作較繁瑣。綜合考慮，為更好地監測蜂蜜中嗜滲酵母，降低檢測限，濾膜法是值得推薦的方法。此外，本研究根據嗜滲酵母的原有配方及微量元素對于嗜滲酵母的生長情況，在原有配方中增加新的成分，分別為馬鈴薯浸出粉、生物素、孟加拉紅，結合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）中該成分的量作為基礎，孟加拉紅的作用是增加觀察背景，故直接選擇通用量。通過對生物素進行單因素試驗，確定新的培養基組分為馬鈴薯浸出粉12 g，酪蛋白胨5.0 g，無水葡萄糖10.0 g，硫酸二氫銨1.0 g，硫酸鎂0.5 g，氯硝胺0.1 g，無水甘油200 g，瓊脂15 g，氯霉素0.1 g，孟加拉紅0.033 g，生物素0.1 g。在該培養基上通過濾膜法培養，可以提高嗜滲酵母的最低檢測限且使培養時間縮短至3 d。因馬鈴薯浸出粉為混合物，而促進蜂蜜中嗜滲酵母快速生長的具體有效成分還有待進一步研究。嗜滲酵母的生長與水分含量有關［14］，一些處理方法也會受影響［15］，因此后期也可對水分含量及處理方法進一步優化。

4 小結

在原有嗜滲酵母計數培養基的基礎上添加孟加拉紅、馬鈴薯浸出粉和生物素獲得新的培養基PDMG18，對涂布法、傾注法及濾膜法微生物定量檢測進行比較，建立了1 種檢測限低、檢測效率較高的適合蜂蜜嗜滲酵母計數的方法。